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尾矿固氮菌的分离筛选及其植物促生效应研究

生态环境学报 2022年第11期31卷 2180-2188页

作者：郭丽芳杨瑞孙蔚旻佛山科学技术学院食品科学与工程学院广东佛山528000 广东省科学院生态环境与土壤研究所/华南土壤污染控制与修复国家地方联合工程研究中心/广东省农业环境综合治理重点实验室广东广州510650

尾矿是一种寡营养环境,含有大量重金属元素,然而营养元素的缺乏,尤其是氮素的缺乏严重阻碍了尾矿生物修复策略的发展。固氮菌可为植物提供可利用性氮,促进尾矿生态修复。然而,目前关于栖息在尾矿中固氮菌的分离研究较少。采用无氮培养... 详细信息

尾矿是一种寡营养环境,含有大量重金属元素,然而营养元素的缺乏,尤其是氮素的缺乏严重阻碍了尾矿生物修复策略的发展。固氮菌可为植物提供可利用性氮,促进尾矿生态修复。然而,目前关于栖息在尾矿中固氮菌的分离研究较少。采用无氮培养基和稀释涂布平板分离法,从湖南怀化溆浦县黄家尾矿分离出7株具有固氮功能的菌株,结果表明,PC-3的固氮酶活性最高(7133.71μmol·h^(−1)·mL^(−1))。IAA、金属抗性和铁载体定性测定结果表明,G6、L31和PC-3同时具备有IAA特性、铁载体和金属抗性的能力。同时研究了菌株的最适生长pH,结果表明大部分菌株在pH偏中性下生长较好,但G6、L2+2在pH=9的条件下生长趋势最好。16S rRNA测序结果表明,上述7株菌分别为Brevundimonas(G15、G18),Xanthobacter(L31),Sphingobium(L2+2),Pseudomonas(PC-3),Mycobacterium(G6),Rhodococcus(L45)。为了进一步探究尾矿固氮菌的植物促生潜力,进行了盆栽试验。与对照组相比,接种L2+2、L31菌株显著提高了植物根长和茎长,其中L31菌株使植物根长和茎长分别增长了130%、93%;接种菌株也显著提高了植物根和茎的干质量,其中接种L2+2处理植物的根、茎的干质量分别增长了260%、188%;接种G6、L31处理植物根和茎的氮含量显著增加,效果最显著的是G6,增长量分别达到406%、131%。结果表明,L2+2、L31和G6具有较大的植物促生潜力,在获取营养物质和促进尾矿的生态演替方面发挥重要作用,可作为生物肥料的良好候选菌株,以促进尾矿生态环境的修复。

关键词：尾矿危害固氮菌重金属污染植物促生生态修复

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拉萨长期不同施肥青稞田土壤固氮菌分离鉴定

麦类作物学报 2023年第4期43卷 505-512页

作者：马瑞萍戴相林刘国一谢永春普布贵吉张国新西藏自治区农牧科学院农业资源与环境研究所西藏拉萨850000 河北省农林科学院滨海农业研究所河北唐山063299

为寻找拉萨青稞田自生固氮菌,丰富当地固氮菌资源,以减少化肥使用量,降低环境负效应,本研究从6种长期不同施肥模式定位试验的青稞田土壤中进行固氮菌的分离、纯化,观察其菌落形态特征并测定各菌株的固氮酶活性,通过16S rDNA基因测序和... 详细信息

为寻找拉萨青稞田自生固氮菌,丰富当地固氮菌资源,以减少化肥使用量,降低环境负效应,本研究从6种长期不同施肥模式定位试验的青稞田土壤中进行固氮菌的分离、纯化,观察其菌落形态特征并测定各菌株的固氮酶活性,通过16S rDNA基因测序和构建系统发育树分析了各菌株的分类学地位。结果显示,通过分离和纯化,共得到自生固氮菌50株,其中13株菌具有高效固氮酶活性,分别属于假食酸菌属(Pseudacidovorax)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、农杆菌属(Agrobacterium)。施用化肥会减少土壤中高效固氮菌种类,不施化肥或施用有机肥能丰富土壤中高效固氮菌种类。

关键词：长期施肥青稞农田固氮菌西藏高原

氟苯尼考联合铜环境胁迫对土壤固氮菌成膜能力及相关基因表达的研究

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华南农业大学学报 2023年第3期44卷 402-409页

作者：梁仪周童白玲王美孙永学华南农业大学兽医学院/国家兽药安全评价(环境评估)实验室/广东省兽药研制与安全评价重点实验室广东广州510642 怀化职业技术学院湖南怀化418400 浙江农林大学动物科技学院动物医学院浙江杭州311300

[目的]研究氟苯尼考和铜(Cu)残留对土壤固氮菌的生态毒性效应,为评价兽药的环境风险提供依据。[方法]对从花生根际土壤中分离出的一株优势固氮菌RpEC2071进行氟苯尼考和铜胁迫处理,试验设置空白组(0μg/mL)、氟苯尼考添加组(40μg/mL)... 详细信息

[目的]研究氟苯尼考和铜(Cu)残留对土壤固氮菌的生态毒性效应,为评价兽药的环境风险提供依据。[方法]对从花生根际土壤中分离出的一株优势固氮菌RpEC2071进行氟苯尼考和铜胁迫处理,试验设置空白组(0μg/mL)、氟苯尼考添加组(40μg/mL)、Cu添加组(200μg/mL)和混合组(氟苯尼考40μg/mL+Cu 200μg/mL),并于给药后采样。采用苯酚硫酸法和96孔法研究氟苯尼考和Cu单独或联合处理对固氮菌胞外多糖产生及生物膜形成能力的影响。采用RT-qPCR测定分析固氮菌生物膜及固氮相关基因的mRNA表达水平。[结果]氟苯尼考和Cu单独胁迫会促进生物膜的形成,二者生物膜形成能力约为空白组的2倍;混合胁迫会抑制生物膜的形成,空白组生物膜形成能力是其3.1倍。胞外多糖分泌结果与生物膜形成能力测定结果基本一致。生物膜相关基因与氮代谢调控基因呈显著正相关,氟苯尼考和Cu的添加改变了fli Q、nif H和nnr R等基因的表达水平,且二者联合处理后会对其表达分别产生协同或拮抗作用。[结论]氟苯尼考与Cu的单独或联合胁迫影响固氮菌RpEC2071中生物膜相关基因表达,进而对其生物膜形成能力产生影响。预示了以氟苯尼考和Cu为例的兽药及重金属残留胁迫会对土壤固氮菌产生潜在的生态毒性效应,从而破坏土壤中固氮生态系统。

关键词：氟苯尼考铜固氮菌胞外多糖生物膜生态毒性

固氮菌与氮肥配施对甘蔗生长影响及应用前景分析

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固氮菌与氮肥配施对甘蔗生长影响及应用前景分析

作者：张瑞楠广西大学

学位级别：硕士

甘蔗是我国最重要的糖料作物,然而当前甘蔗种植中普遍存在氮肥过量的现象,严重制约甘蔗产业的可持续发展。研究表明,甘蔗固氮菌能与甘蔗联合固氮,并通过多种机制促进甘蔗生长。因此,若能充分发挥固氮菌的联合固氮作用,对甘蔗生产中氮肥... 详细信息

甘蔗是我国最重要的糖料作物,然而当前甘蔗种植中普遍存在氮肥过量的现象,严重制约甘蔗产业的可持续发展。研究表明,甘蔗固氮菌能与甘蔗联合固氮,并通过多种机制促进甘蔗生长。因此,若能充分发挥固氮菌的联合固氮作用,对甘蔗生产中氮肥减施具有重要意义。本研究通过设置施氮量、固氮菌种类和甘蔗品种三个因素,探究固氮菌与氮肥配施对甘蔗生长的影响。并根据试验结论,就固氮菌及微生物菌肥与氮肥配施的应用前景进行分析。研究结果可为甘蔗产业优化施肥提供参考依据。研究主要结果如下:（1）不同氮水平下,探究接种两个不同固氮菌对两个甘蔗品种农艺性状的影响。结果表明,与未接菌的对照相比,接菌处理都不同程度地提高了甘蔗的生物量和株高。相比于施肥300 kg/ha不接菌处理,减氮25%并接种内生固氮菌DX120E的处理对甘蔗株高、生物量的促进作用最为显著。相同氮水平下,接种处理的蔗糖分含量都高于对照处理,且接种DX120E的效果优于XD20和XD20+DX120E处理。两个品种相比,对甘蔗品种GT42的效果优于ROC22品种。（2）不同氮水平下,探究接种两个不同固氮菌对两个甘蔗品种生理特性的影响。结果表明,减少25%的氮素和50%的氮素,接种两个固氮菌株DX120E和XD20都提高了两个甘蔗品种的叶面积、叶片氮含量、叶绿素含量和光合气体交换参数。减施氮50%时,接种DX120E处理对甘蔗品种GT42叶绿素含量的影响显著优于ROC22。多个处理间相比,对光合气体交换参数:净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间二氧化碳浓度的影响,都以减氮25%时分别接种菌株DX120E和XD20的处理促进效果最显著,而同时接种这两个菌株的处理,其对光合作用的促进作用减弱。（3）相比于施肥300 kg/ha不接菌处理,减氮50%和减氮25%,接种两个固氮菌都提高了两个甘蔗品种的生理特性,特别是对甘蔗光合作用的促进作用更明显。基于本试验结果,若从可持续发展的角度考虑,在甘蔗生产管理中建议减氮50%并接种固氮菌。若从农户经济效益角度考虑,建议在甘蔗种植管理中选择减氮25%并接种固氮菌。（4）固氮菌与氮肥配施在生产中应用前景诱人。减氮25%能节约尿素投入1.74亿元/榨季,使碳足迹降低33.26%,具备经济与生态效益。微生物菌肥作为氮肥潜在的部分替代者,针对目前存在的问题对其良性发展提出建议:一要加大资金投入;二要强化科技研究;三要规范肥料生产;四要加强农民培训。通过打造“互联网+农业”平台高效对接信息、运用广西良种繁育基地建立示范、借助扶绥科技小院指导生产,因地制宜推动微生物菌肥在广西甘蔗产业中蓬勃发展。

关键词：甘蔗固氮菌生长光合特性应用前景

水体氮浓度对浮萍及其附生固氮菌相互作用的影响研究

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水体氮浓度对浮萍及其附生固氮菌相互作用的影响研究

作者：杨玉婷云南大学

学位级别：硕士

浮萍,作为一种全球分布的水生漂浮植物,因能吸收水体中营养物质并生产富含淀粉和蛋白质的生物质,是实现水质净化及高品质生物质生产的理想植物。研究表明,浮萍附生有大量固氮菌并表现出较强的固氮能力,然而,截止目前,浮萍附生固氮菌组... 详细信息

浮萍,作为一种全球分布的水生漂浮植物,因能吸收水体中营养物质并生产富含淀粉和蛋白质的生物质,是实现水质净化及高品质生物质生产的理想植物。研究表明,浮萍附生有大量固氮菌并表现出较强的固氮能力,然而,截止目前,浮萍附生固氮菌组成以及附生固氮菌与浮萍的相互作用及其影响因素,尤其是氮浓度的影响几乎未见报道,有待进一步研究。因此,本研究以浮萍(Lemna japonica)及其附生固氮菌为对象,先在实验室的开放培养体系中开展硝态氮浓度(0-60 mg·L)对浮萍及其附生固氮菌的影响。并通过纯培养分离纯化相关固氮菌株,挑选浮萍促生性能优越的菌株,在无菌纯培养体系中开展氮浓度对固氮菌与无菌浮萍相互作用的影响研究,并通过基因组、转录组及代谢组手段进一步研究固氮菌的浮萍促生机制。研究结果表明:(1)在开放培养体系中,氮浓度既影响浮萍生长,也影响浮萍的主要形态特征及组成。其中,浮萍平均生长速率、叶面积和叶厚度、叶绿素含量、氮磷含量和含水率均随氮浓度的增加而升高,而浮萍根长则随氮浓度增加而变短。(2)在开放培养体系中,氮浓度也影响浮萍附生细菌和附生固氮菌的物种多样性和群落组成。其中,浮萍附生细菌和附生固氮菌的多样性随氮浓度的增加而增大,但氮浓度对浮萍附生固氮菌的丰富度无显著影响;此外,氮浓度显著影响浮萍附生固氮菌优势类群的富集,大部分浮萍附生固氮菌群,如Bradyrhizobium、Rhizobium和Burkholderiales unclassified等的相对丰度与氮浓度呈负相关关系,表明低氮浓度有利于大部分浮萍附生固氮菌群的富集。(3)通过分离纯化及筛选,获得浮萍促生效果优越的固氮菌株NF-3,16S r DNA和基因组测序表明该菌株属于Bacillus licheniformis,基因组大小为4.26 Mb,基因组中含有大量与氮固定和代谢相关的基因,如与氮固定相关的nif基因簇中的nif Z、nif U和nif S基因,与氮代谢相关的Gln基因簇中的Gln N、Gln T、Gln K、Gln A基因,以及与氨同化相关的编码硝酸还原酶、谷氨酸合成酶和谷氨酸脱氢酶的基因序列。(4)在纯培养体系中,氮浓度(0-60 mg·L)并未显著影响浮萍的生长速率,然而,菌株NF-3在所有氮浓度下均能促进浮萍生长,并且低氮(尤其是无氮)环境的促生效果好于中高氮环境,其中,无氮条件下菌株NF-3可使浮萍的生长速率提高1.47倍,此外,菌株NF-3也能在无氮和低氮条件下显著提高浮萍的叶绿素含量及浮萍硝酸还原酶(NR)和谷氨酸合成酶(GOGAT)活性。(5)从纯培养体系的培养液中共鉴定出648种代谢物,其中,浓度升高的代谢物种类在共培组中明显更多,表明与浮萍或菌株NF-3单培相比,浮萍和固氮菌共培有利于合成更多代谢物。同时,还发现共培组中部分植物促生物质(如丙酸、吲哚乙酸和亚精胺浓度)的浓度显著高于单培组,菌株NF-3的浮萍促生作用可能与在这些物质的大量分泌有关。此外,在菌株NF-3的转录组基因片段中,发现了一些与氮固定和氮同化相关的基因,表明菌株NF-3的浮萍促生作用也可能与氮固定有关。综上所述,开放培养体系中的浮萍植株拥有丰富的附生细菌和附生固氮菌群,这些菌群与浮萍生长状况一样,会受到水环境中氮浓度的影响,从浮萍上分离并鉴定的固氮菌株Bacillus licheniformis NF-3具有良好的浮萍促生效果,且低氮(尤其是无氮)环境中的促生效果明显好于中高氮浓度环境,结合菌株基因组、转录组、培养液代谢组及浮萍生理指标等数据,推测菌株NF-3主要通过固氮作用供应氮素和分泌植物促生物质两种途径促进浮萍生长,两种途径的贡献大小受氮浓度的影响。该研究弥补了氮浓度对浮萍及其浮萍附生固氮菌群影响研究的不足,丰富了对浮萍附生固氮菌株促生机制的认识,为固氮微生物在浮萍培养及水体净化中的应用提供了一定的微生物资源和理论依据。

关键词：浮萍固氮菌氮浓度植物微生物相互作用植物促生机制

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高寒草地土壤固氮菌的分布特征及其影响因素

高寒草地土壤固氮菌的分布特征及其影响因素

作者：雷石龙西北农林科技大学

学位级别：硕士

生物固氮是指固氮菌通过体内固氮酶的催化作用将大气中的氮气转换成铵来补充土壤氮库,是生态系统重要的氮输入方式,对缓解土壤退化、减少氮肥的使用有重要作用。青藏高原海拔较高,生境脆弱,加之气候变化和人类活动的影响,高寒草地退化严... 详细信息

生物固氮是指固氮菌通过体内固氮酶的催化作用将大气中的氮气转换成铵来补充土壤氮库,是生态系统重要的氮输入方式,对缓解土壤退化、减少氮肥的使用有重要作用。青藏高原海拔较高,生境脆弱,加之气候变化和人类活动的影响,高寒草地退化严重,生物多样性急剧丧失,给人们的生产、生活带来了极大的困难,而生物固氮能够增加草地氮含量、提高植被生产力进而缓解草地退化。目前,关于固氮菌的丰度和多样性在高寒草地的分布以及驱动因素仍没有一致的结论。因此,研究高寒草地土壤固氮菌群落的分布及其影响因素对高寒草地管理措施的制定有重要意义。本研究以青藏高原三种类型草地(高寒草甸、高寒草原和高寒荒漠草原)为研究对象,采用实时荧光定量PCR和扩增子测序技术,系统分析了固氮菌群落在高寒草地的分布及其影响因素,主要结果如下:(1)从高寒草甸到高寒草原再到高寒荒漠草原转变的过程中,植物群落优势种由高山嵩草逐步变为紫花针茅再转变为沙生针茅,植物群落的多样性、盖度和生物量下降,优势功能群由莎草科转变为杂类草;土壤含水量降低,容重和p H增加,水溶性有机碳、有机碳、全氮、水溶性有机氮、铵态氮、硝态氮和速效磷均下降,而速效钾含量增加。(2)高寒草地固氮菌群落总体、稀有种和丰富种均主要由变形菌(Proteobacteria,相对丰度分别为76.6%,83.7%和71.2%)、蓝藻菌(Cyanobacteria,相对丰度分别为3.5%,5.6%和1.2%)和疣微菌(Verrucomicrobia,相对丰度分别为2.8%,2.7%和2.2%)组成。高寒草甸中固氮菌群落总体的变形菌相对丰度小于高寒草原和高寒荒漠草原,其蓝藻菌和疣微菌大于高寒草原和高寒荒漠草原,丰富种的蓝藻菌和疣微菌以及稀有种的蓝藻菌的相对丰度为高寒荒漠草原>高寒草原>高寒草甸。固氮菌群落总体的固氮菌丰度、α和β多样性均为高寒草甸>高寒草原>高寒荒漠草原,稀有种α和β多样性大于丰富种。(3)随机性过程(漂变和扩散限制)主导了高寒草地土壤固氮菌的群落构建。从高寒草甸到高寒草原再到高寒荒漠草原,扩散限制的相对重要性逐渐降低(53.9～13.4%),漂变的相对重要性逐渐增加(35.7～71.1%)。固氮菌互作网络的边数、节点数和平均度为高寒草甸>高寒草原>高寒荒漠草原,而高寒草甸和高寒荒漠草原的网络密度、模块化系数、紧密中心性和平均路径长度均大于高寒草甸。(4)固氮菌丰度与土壤有机碳、干旱度和全氮相关性最强。土壤有机碳、土壤含水量和植物生物量与固氮菌总体和稀有种的α和β多样性相关性最强,而丰富种与有机碳、土壤水分和全氮相关性最强。植被因子对固氮菌丰度的直接影响最大(0.751),气候因子对固氮菌α多样性的直接作用最大(0.635),物种互作对β多样性的直接作用最大(0.676)。综上所述,高寒草甸的植被生产力、多样性和土壤养分均优于高寒草原和高寒荒漠草原,导致其固氮丰度、固氮菌α和β多样性在高寒草甸较高。此外,稀有种最易受环境的影响,其对环境因子的响应与固氮菌总体一致,与丰富种相反。气候因子直接驱动了固氮菌丰度和α多样性,而物种互作对β多样性的直接驱动作用最强。以上结果揭示了高寒草地土壤固氮菌群落分布及其影响因素,可为高寒草地固氮菌多样性的维持机制和草地退化的治理提供理论依据。

关键词：高寒草地固氮菌微生物群落群落构建网络分析

生物炭负载固氮菌Azotobacter sp. MS1对土壤中四环素的去除

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生物炭负载固氮菌Azotobacter sp. MS1对土壤中四环素的去除

作者：单嵘博东北农业大学

学位级别：硕士

四环素类抗生素是一类常用的广谱抗生素,是畜禽养殖业中广泛应用的饲料添加剂。四环素在动物体内不能完全代谢,大部分都以抗生素原型或次级代谢产物随畜禽粪便排出体外,因此养殖废水和畜禽粪便往往含有大量的四环素及其残体。养殖废水... 详细信息

四环素类抗生素是一类常用的广谱抗生素,是畜禽养殖业中广泛应用的饲料添加剂。四环素在动物体内不能完全代谢,大部分都以抗生素原型或次级代谢产物随畜禽粪便排出体外,因此养殖废水和畜禽粪便往往含有大量的四环素及其残体。养殖废水排放的处理不当以及畜禽粪便作为肥料使用,都会使大量的四环素在环境中尤其是土壤环境中积累,造成土壤的生态危害。环境中的四环素又往往会随着食物链等路径迁移到人体中,对人类健康产生潜在威胁。目前,四环素对植物生理影响及其作用机理的相关研究较少,且大多集中于水生植物,对于陆生植物的研究鲜有报道。本研究以北方常见作物四季青小白菜（Brassica campestris *** Makino *** Tsen et Lee）及种植土壤的微生物群落为研究对象,采用玉米秸秆生物炭（以下简称Biochar）负载固氮菌Azotobacter ***1（以下简称Biochar@Azotobacter ***1）作为减毒材料,研究了Biochar@Azotobacter ***1对四环素污染土壤中的小白菜及土壤微生物群落的保护作用。本文得出了以下结论:（1）分离得到一株具有固氮酶基因的细菌Azotobacter ***1,经鉴定MS1为变形菌门,变形菌纲,假单胞菌目,假单胞菌科,固氮菌属。采用玉米秸秆生物炭作为载体对Azotobacter ***1进行负载并使用比表面积分析仪、扫描电子显微镜和傅里叶红外光谱仪对Biochar及Biochar@Azotobacter ***1的比表面积、形态结构和表面官能团进行了分析,结果表明:Azotobacter ***1可以负载到Biochar上,Azotobacter ***1与Biochar的结合方式为物理吸附。Biochar@Azotobacter ***1孔隙结构更丰富,与Biochar相比,Biochar@Azotobacter ***1可以吸附四环素的结合位点增加。（2）四环素吸附动力学试验表明,Biochar@Azotobacter ***1对四环素的吸附效果更强（吸附能力:Biochar@Azotobacter ***1>Biochar>对照）。Biochar和Biochar@Azotobacter ***1对四环素的吸附动力学符合准一级动力学描述。四环素吸附热力学试验结果表明Biochar@Azotobacter ***1对四环素的吸附热力学符合Langmuir模型描述,40℃时最大吸附量达为382.19 mg·g,且吸附过程属于自发的吸热过程。（3）四环素会抑制小白菜的生长,主要表现为发芽率抑制、生物量和叶绿素含量降低并产生氧化应激。在四环素染毒土壤中添加了Biochar@Azotobacter ***1之后,小白菜的基础表型、抗氧化系统和根际土壤微生物群落均发生了变化。其中,小白菜的生物量、叶绿素含量均提升,根系的长度、体积和根尖数也均有提升。而过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活力及丙二醛（MDA）的含量降低。此外,Biochar@Azotobacter ***1对染毒土壤中小白菜根系土的微生物群落多样性具有改善作用。说明Biochar@Azotobacter ***1能够有效缓解四环素对小白菜生长发育的抑制作用,改善土壤微生物群落多样性,起到减弱四环素毒性,保护小白菜生长的作用。

关键词：四环素生物炭固氮菌小白菜减毒效应

不同种植年限紫花苜蓿地养分、固氮菌和硝化菌特征研究

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不同种植年限紫花苜蓿地养分、固氮菌和硝化菌特征研究

作者：吴杰河南科技大学

学位级别：硕士

紫花苜蓿土壤养分与固氮菌、硝化菌的特征变化及关系是影响苜蓿生产过程中养分利用与调控的基础,而针对豫西旱田由传统种植模式改种苜蓿后土壤的养分变化特征,以及苜蓿草地的固氮菌和硝化菌的群落特征还不够明确。因此,本研究选择河南... 详细信息

紫花苜蓿土壤养分与固氮菌、硝化菌的特征变化及关系是影响苜蓿生产过程中养分利用与调控的基础,而针对豫西旱田由传统种植模式改种苜蓿后土壤的养分变化特征,以及苜蓿草地的固氮菌和硝化菌的群落特征还不够明确。因此,本研究选择河南省豫西丘陵区的小麦-玉米轮作传统耕地为对照(CK)土壤,主要调查上述土壤改种紫花苜蓿1-5a后各土壤层(0-60 cm)的养分特征;各年限表层土壤(0-10 cm)固氮菌、硝化菌群落多样性变化规律,进一步探究苜蓿种植3a时上述氮循环微生物在各土层(0-60 cm)的分布规律,并探究土壤养分与固氮菌、硝化菌之间的相关性,为今后苜蓿生产过程中的养分管理和调控提供依据。本研究主要得到的结果如下:(1)土壤养分和p H在不同种植年限苜蓿地和土层深度上存在不同的变化趋势:苜蓿不同种植年限土壤的p H值、养分含量随着土层深度的增加而降低,并均在0-30 cm各土层中随年限的增加波动较大,而在30-60 cm各土层中随年限的增加差异较小。并且,土壤养分在苜蓿生长旺盛的3、4a时较传统耕地增加。总的来说,表土层的土壤有机质、全氮、碱解氮、速效磷、速效钾含量最高,并且随着土层深度增加而不断降低,并在30-60 cm土层逐渐趋于一致。土壤剖面中,同土层的有机质、全氮、碱解氮、速效磷、速效钾含量在3a或4a时为最高值,而p H则在1a和5a时为较高。(2)土壤固氮菌微生物群落结构在苜蓿种植年限和土层深度上存在差异,其中固氮菌群落中的优势门均属变形菌门,但优势属会随种植年限的增加,从慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)逐渐演替为氮氢单胞菌属(Azohydromonas),且固氮菌在苜蓿种植3-4a的表层土壤(0-10 cm)具有较高的多样性和丰富度,而在苜蓿种植3a时随着土层深度的增加逐渐降低。另外,固氮菌的α多样性指数在苜蓿种植年限和土壤深度尺度上与土壤养分均呈正相关关系,而土壤p H值则与固氮菌的α多样性指数呈现负相关关系,其中有机质、全氮、碱解氮、速效磷为显著影响固氮菌的α多样性。(3)氨氧化古菌(AOA)的优势门是泉古菌门(Crenarchaeota),AOA在苜蓿种植1-2a和5a的表层土壤及3a的深层土壤中具有较高的多样性和丰富度。而氨氧化古菌(AOB)的优势门为变形菌门(Proteobacteria),并以亚硝化螺菌属(Nitrosospira)为主,且AOB在3a、4a的表层土壤(0-10 cm)具有较高的多样性和丰富度,并在3a时随着土层深度的增加逐渐降低。另外,土壤养分分别与AOA和AOB呈负相关和正相关关系,而土壤p H值则与AOA和AOB呈正相关和负相关关系,土壤养分中有机质、全氮、碱解氮、速效磷为显著影响AOB的α多样性。(4)紫花苜蓿植株的养分含量、产量和品质指标会随着种植年限的变化而表现出明显差异性。紫花苜蓿产量和茎叶的养分含量随着种植年限的增加呈现出先升后降的趋势,在紫花苜蓿种植3a时达到最高;紫花苜蓿根部的养分含量则整体上随着种植年限的增加表现出降低的趋势,其1a的含量最高。不同种植年限紫花苜蓿的品质指标中粗蛋白、灰分、钙、磷的含量均是在苜蓿种植3a时最高。并且与动物的采食量和消化率呈现负相关关系的粗纤维、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维在苜蓿种植3a时最低。可见,传统耕地改种苜蓿后,根据不同年限的土壤养分含量变化特征和固氮菌、硝化菌特征的差异以及苜蓿植株的养分、产量和品质变化,可以为不同年份紫花苜蓿种植管理过程中养分施肥调控提供依据。

关键词：紫花苜蓿土壤养分固氮菌 AOA AOB 微生物多样性

内蒙古土默特平原盐碱地水稻根圈固氮菌的分离鉴定及其基因组分析

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内蒙古土默特平原盐碱地水稻根圈固氮菌的分离鉴定及其基因组分析

作者：刘晶晶内蒙古大学

学位级别：硕士

我国的盐碱地面积约为9913万公顷,盐度超过0.6%、p H值超过9的高盐碱地数量每年增加1.4%。改善盐碱地资源并提高其生产力是确保粮食供应和限制盐碱地对耕地破坏的重要步骤。利用固氮微生物改善植物根系间的土壤环境,提高农作物的产量是... 详细信息

我国的盐碱地面积约为9913万公顷,盐度超过0.6%、p H值超过9的高盐碱地数量每年增加1.4%。改善盐碱地资源并提高其生产力是确保粮食供应和限制盐碱地对耕地破坏的重要步骤。利用固氮微生物改善植物根系间的土壤环境,提高农作物的产量是改善盐碱地的重要方法。在我们前期的分子生物学研究结果显示,盐碱地水稻根圈固氮菌以Azotobacter、Methylomonas和Azoarcus为优势固氮菌,其中Azotobacter和Azoarcus属于耐盐碱固氮菌。本研究以内蒙古呼和浩特市盐碱地优质水稻品种选育基地的水稻为研究对象,主要利用无氮培养基从水稻根系、根际土和叶等不同部位分离耐盐固氮细菌,再用nif H基因扩增法筛选,对关键的固氮菌进行分类鉴定、固氮活性测定及基因组测序,主要研究结果如下:(1)使用SSM和R2A两种培养基从土模特左旗水稻的不同部位中共分离得到93株菌,所分离细菌分属于α变型杆菌纲(Alphaproteobacteria)(9.7%)、放线菌纲(Actinobacteria)(22.6%)、杆菌(Bacilli)(10.7%)、β变形菌纲(Betaproteobacteria)(7.5%)、黄杆菌纲(Flavobacteriia)(6.5%)以及γ变形菌纲(Gammaproteobacteria)(43%)共六个纲。在属水平上,Gammaproteobacteria的固氮菌属(Azotobacter)(6.5%)较优势,其中代表菌株SGS-4与其已知最亲缘模式菌Azotobacter salinestris NBRC 102413的16S r RNA基因序列相似度为98.95%。因此,成功分离出之前用测序技术检测到的水稻根圈优势固氮菌之一的Azotobacter。(2)对代表菌株SGS-4从形态学、生理生化特征、系统发育分析等多方面分析其功能与性质。菌株SGS-4为革兰氏染色阴性菌,p H值为6-11,温度为28-40℃下可以生长。乙炔还原法的固氮酶活实验结果表明,该菌株最高的固氮活性为6965.7 nmol CH/h。(3)全基因组测序结果显示,菌株SGS-4的基因组大小为4794513 bp,GC含量为66.15%,共有4324个基因。与模式菌Azotobacter salinestris的核酸平均核苷酸相似度(ANI)为96.5%,说明该菌株属于Azotobacter salinestris种。(4)菌株SGS-4的基因组功能注释结果表明,该菌具有钼固氮酶编码基因nif HDK和钒固氮酶编码基因vnf HDK以及同化硝酸盐还原酶基因簇nas ACEKBDTS,这在基因水平上支持了其固氮活性。该菌株具有钠离子/氢离子反转运蛋白,还具有产吲哚乙酸相关基因及解磷相关基因等促生相关的基因,说明菌株SGS-4具有耐盐碱水稻联合固氮潜力。本研究通过传统分离技术从水稻根际土中成功分离出具有耐盐碱的固氮功能的一株菌,具有较强的固氮能力,为进一步治理内蒙古盐碱地奠定了科学基础和理论依据,同时也为内蒙古盐碱地氮含量和改善土质提供了菌种资源。

关键词：盐碱地固氮菌微生物分离水稻根际土基因组分析