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腓骨肌萎缩症2L热休克蛋白B8过表达对细胞相对活力的影响

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中华医学遗传学杂志 2011年第5期28卷 528-531页

作者：李书剑唐北沙赵国华张如旭夏昆潘乾河南省人民医院神经内科郑州450003 中南大学湘雅医院神经内科中国医学遗传学国家重点实验室

目的探讨轴索型腓骨肌萎缩症2L（axonal Charcot—Marie-Tooth disease type 2L，CMT2L）K141N突变的热休克蛋白B8（heat shock protein B8，HSPB8）对细胞相对活力的影响。方法应用脂质体转染技术，将野生型HSPB8（wtHSPB8）和K141N突变型HSPB8（K141NHSPB8）分别转染SHSY-5Y细胞，使其过量表达上述蛋白，以表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）为阴性对照，转染24h后用44℃致死性热休克处理40min，用四甲基偶氮唑蓝（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）比色法检测SHSY-5Y细胞的相对活力。结果未处理组pEGFP-wtHSPB8与pEGFP-K141NHSPB8组间吸光度值比较P〉0．05，而热休克处理组pEGFP1-W1HSPB8与pEGFP-k141NHSPB8组间吸光度值比较P〈0．05，表明热休克处理后各组细胞相对活力差异有统计学意义，热休克处理后过表达wtHSPB8的SHSY-5Y细胞活力最高，过表达K141NHSPB8的细胞次之，过表达GFP空载体的细胞活力最低。结论证实了HSPB8在细胞受到致死性热休克刺激时对于保护细胞活力方面起着重要作用，K141N突变型HSPB8对细胞相对活力的保护作用较野生型HSPB8减弱。

关键词：腓骨肌萎缩症热休克蛋白B8 细胞相对活力四甲基偶氮唑蓝比色法

表达特异性多肽的噬菌体对卵巢癌细胞生物学行为的影响

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中华妇产科杂志 2005年第10期40卷 685-688页

作者：王世宣马湘一周洪源陈刚何福仙卢运萍马丁华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科武汉430030

目的探讨表达特异性多肽的噬菌体对卵巢癌细胞生物学行为的影响。方法选取卵巢癌细胞株A2780、SKOV3,分别与特异性的噬菌体共同作用,通过台盼蓝拒染法、流式细胞仪、平板克隆形成实验、四甲基偶氮唑蓝比色法、Boyden小室体外侵袭实验等... 详细信息

目的探讨表达特异性多肽的噬菌体对卵巢癌细胞生物学行为的影响。方法选取卵巢癌细胞株A2780、SKOV3,分别与特异性的噬菌体共同作用,通过台盼蓝拒染法、流式细胞仪、平板克隆形成实验、四甲基偶氮唑蓝比色法、Boyden小室体外侵袭实验等方法,检测卵巢癌细胞生物学行为的变化。将A2780、SKOV3细胞按实验目的分别分为3组:(1)实验组,加入可与卵巢癌细胞特异性结合的噬菌体(阳性噬菌体);(2)空白对照组,不加噬菌体;(3)阴性对照组,加入不与卵巢癌细胞结合的噬菌体(阴性噬菌体)。结果实验组、阴性对照组和空白对照组的平均活细胞比例分别为(72·1±6·2)%、(84·8±4·6)%和(93·1±2·5)%,与阴性对照组及空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0·05);实验组A2780和SKOV3细胞的凋亡率分别为20·39%和43·99%,而阴性对照组均未见凋亡峰的出现;实验组细胞的平均克隆形成率为4%,阴性对照组为15%,空白对照组为15%,实验组与阴性对照组及空白对照组分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);实验组A2780和SKOV3细胞的生长抑制率分别为11·07%和9·58%,均明显高于各自的阴性对照组(分别为2·05%和1·09%),与各自的阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);实验组A2780和SKOV3细胞的侵袭指数,都低于各自的阴性对照组和空白对照组,分别与各自的阴性对照组和空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0·05)。结论筛选出的特异性噬菌体对卵巢癌细胞的生长、增殖和迁移有一定的下调作用,与噬菌体结合的卵巢癌细胞表面受体可能与肿瘤的发生和转移有关。

关键词：卵巢肿瘤肽库卵巢癌细胞株细胞生物学行为特异性多肽噬菌体 SKOV3细胞四甲基偶氮唑蓝比色法克隆形成实验 A2780

蛋白激酶Cα对浅表膀胱癌分化及阿霉素内源性耐药的作用

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中华外科杂志 2005年第10期43卷 662-666页

作者：朱育焱王海明孔垂泽柳东辉李泽良孙志熙刘革非中国医科大学附属第一医院泌尿外科沈阳110001 内蒙古自治区赤峰平庄矿务局西露天矿医院中国医科大学卫生部国家重点实验室细胞生物学教研室

目的探讨蛋白激酶C(PKC)α与浅表膀胱癌细胞分化及内源性耐药的关系。方法采用蛋白印迹法检测76例临床标本(浅表膀胱癌及正常组织)中PKCα的表达水平,对所有患者行标准化疗后随访4～24个月,分析PKCα表达及活化与复发的关系。应用人浅... 详细信息

目的探讨蛋白激酶C(PKC)α与浅表膀胱癌细胞分化及内源性耐药的关系。方法采用蛋白印迹法检测76例临床标本(浅表膀胱癌及正常组织)中PKCα的表达水平,对所有患者行标准化疗后随访4～24个月,分析PKCα表达及活化与复发的关系。应用人浅表膀胱癌细胞系RT4细胞,建立能够稳定表达PKCα绿色荧光蛋白(GFP)的人膀胱癌细胞系RT4/PKCαGFP。用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定RT4/PKCαGFP和亲代细胞对阿霉素的敏感性。分别检测PKCα激活和抑制状态下RT4/PKCαGFP对阿霉素敏感性的差异。结果在癌组织中,PKCα总体表达水平和胞膜、胞浆中表达水平的比值(M/C值),均显著高于正常组织(癌组织为正常组织的2.2倍,t=1.98,P<0.05;M/C值癌组织为0.84±0.12,正常组织为0.23±0.11,t=2.62,P<0.01)。随着肿瘤分级的升高,胞膜中PKCα的相对表达的水平显著升高(P<0.01),胞浆中的相对表达水平显著下降(P<0.01),PKCα的M/C值显著升高(P<0.01),总体PKCα相对表达水平显著升高(P<0.01)。70例获随访,共复发38例。多因素分析表明,高PKCαM/C值是影响化疗后近期复发的独立预后因素(相对危险度3.98,95%可信区间1.22～5.68,P=0.03)。转染PKCα基因后,RT4细胞对阿霉素的耐药性增强(耐药指数6.97,t=3.24,P<0.01)。

关键词：浅表膀胱癌阿霉素内源性蛋白激酶Cα 蛋白激酶C(PKC) 四甲基偶氮唑蓝比色法膀胱癌细胞系 RT4细胞 PKCα 正常组织绿色荧光蛋白相对表达耐药指数癌细胞分化蛋白印迹法多因素分析相对危险度癌组织临床标本稳定表达

孕三烯酮对体外培养异位子宫内膜细胞生长及凋亡的影响

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中华妇产科杂志 2005年第5期40卷 327-330页

作者：马佳佳陈必良马向东曹云新第四军医大学西京医院妇产科西安710033 第四军医大学西京医院基础部免疫学教研室西安710033

目的探讨孕三烯酮对体外培养的子宫内膜异位症(内异症)患者的异位子宫内膜细胞(异位内膜细胞)生长及凋亡的影响,及第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tension homologue deleted on chromosome 10,PTEN)基因在... 详细信息

目的探讨孕三烯酮对体外培养的子宫内膜异位症(内异症)患者的异位子宫内膜细胞(异位内膜细胞)生长及凋亡的影响,及第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tension homologue deleted on chromosome 10,PTEN)基因在异位内膜细胞表达的变化.方法以0、10-6和10-4 mol/L浓度的孕三烯酮,对体外培养的异位内膜细胞分别进行处理;采用四甲基偶氮唑蓝比色法,检测孕三烯酮对异位内膜细胞作用0～48 h的细胞抑制情况并绘制细胞生长曲线;应用透射电镜观察孕三烯酮对异位内膜细胞作用24 h时的细胞超微结构变化;采用流式细胞仪检测异位内膜细胞凋亡率及细胞周期变化;应用PTEN单克隆抗体,经流式细胞仪分析异位内膜细胞PTEN基因的表达.结果孕三烯酮作用于异位内膜细胞8、16、24、32、40和48 h的细胞生长率,在孕三烯酮浓度为10-6 mol/L时,分别为99.6%、87.3%、79.8%、62.3%、51.7%和44.2%;在10-4 mol/L时,分别为99.2%、77.1%、69.6%、51.1%、33.7%和23.6%.同一浓度各作用时间比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).孕三烯酮作用24 h后,异位内膜细胞发生典型的细胞凋亡形态学改变.浓度为10-6、10-4 mol/L的孕三烯酮作用于异位内膜细胞后,凋亡率分别为1.3%、15.0%;浓度为0 mol/L的孕三烯酮作用后,异位内膜细胞凋亡率为0,前后两者比较,差异有统计学意义 (P＜0.05).浓度为0 mol/L的孕三烯酮作用于异位内膜细胞后,PTEN基因的表达率为60.6%,浓度为10-6、10-4 mol/L的孕三烯酮作用后,异位内膜细胞PTEN基因的表达均有不同程度的上调,分别为75.3%和85.7%,显著高于孕三烯酮浓度为0 mol/L者,前后两者比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论孕三烯酮能明显抑制异位内膜细胞的生长、增殖,这一效应可能与通过上调PTEN基因的表达及诱导细胞凋亡有关.

关键词：孕三烯酮体外培养异位子宫内膜异位内膜细胞四甲基偶氮唑蓝比色法 PTEN基因 mol/L 子宫内膜异位症流式细胞仪检测流式细胞仪分析细胞凋亡率 moL/L 子宫内膜细胞细胞生长曲线超微结构变化透射电镜观察诱导细胞凋亡

藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌A549细胞增殖的影响

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中国老年学杂志 2011年第21期31卷 4180-4183页

作者：杜庆聪裴艳涛杨国涛孙雪飞尹秋伟吴铭生武警山东省总队医院山东大学齐鲁医院胸外科山东济南250012

目的探讨藤梨根乙酸乙酯提取物影响肺癌A549细胞生长增殖的作用机制。方法体外培养肺癌A549细胞,分别给予不同浓度的藤梨根乙酸乙酯提取物进行干预,倒置显微镜观察藤梨根乙酸乙酯提取物作用后A549细胞形态学变化,四甲基偶氮唑蓝比色法(M... 详细信息

目的探讨藤梨根乙酸乙酯提取物影响肺癌A549细胞生长增殖的作用机制。方法体外培养肺癌A549细胞,分别给予不同浓度的藤梨根乙酸乙酯提取物进行干预,倒置显微镜观察藤梨根乙酸乙酯提取物作用后A549细胞形态学变化,四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测藤梨根乙酸乙酯提取物对A549细胞增殖活性的影响,集落形成实验观察藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌克隆原细胞增殖的影响,3H-掺入法检测藤梨根乙酸乙酯提取物对A549细胞DNA合成的影响,免疫组化SP法检测用药后A549细胞Ki-67抗原表达变化。结果倒置显微镜下观察细胞形态学变化、MTT实验、集落形成实验结果均显示在体外藤梨根乙酸乙酯提取物在一定浓度下可以抑制肺癌A549细胞的生长,当药物浓度在20～160μg/ml时,抑制呈现出明显的时间和剂量依赖性。并且A549细胞cpm值及增殖指数随着药物剂量的增加和作用时间的延长而逐渐降低,仍以40、80、160μg/ml组作用明显,与对照组比较差异显著,有统计学意义(P<0.05)。结论藤梨根乙酸乙酯提取物可以明显抑制肺癌A549细胞的生长、增殖,其机制可能与抑制细胞DNA合成、降低Ki-67抗原表达有关。

关键词：藤梨根提取物肺肿瘤 Ki-67抗原四甲基偶氮唑蓝比色法 DNA合成

MTT分析法检测氨甲蝶呤对映体对ECV304内皮细胞的细胞毒性

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中国医院药学杂志 2009年第20期29卷 1701-1704页

作者：郭立方王荣贾正平谢华施有琴兰州大学药学院甘肃兰州730000 兰州军区兰州总医院药理基地.甘肃兰州73050

目的：研究手性药物氨甲蝶呤（MTX）消旋体与单一对映体对ECV304内皮细胞的细胞毒性。方法：设置溶剂对照组及氨甲蝶呤（MTX）单一体与消旋体不同浓度组、时间组，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测各组细胞存活和生长情况，分析量... 详细信息

目的：研究手性药物氨甲蝶呤（MTX）消旋体与单一对映体对ECV304内皮细胞的细胞毒性。方法：设置溶剂对照组及氨甲蝶呤（MTX）单一体与消旋体不同浓度组、时间组，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测各组细胞存活和生长情况，分析量效关系、时效关系。结果：在0．1～5μmol·L^-1浓度范围内．（＋）MTX、（±）MTX对ECV304内皮细胞有明显抑制作用（P〈0．01）．而（-）MTX相对抑制较弱。在药物作用72h后各组的细胞抑制率均达到高峰。结论：在一定浓度范围．（±）MTX、（＋）MTX对ECV304内皮细胞有细胞毒性，而（-）MTX则相对不明显。

关键词：手性药物氨甲蝶呤 ECV304内皮细胞四甲基偶氮唑蓝比色法

土大黄提取物中蒽醌类成分的含量测定及其对ECV-304细胞的增值作用

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中药药理与临床 2012年第3期28卷 144-146页

作者：张燕李治建夏木西努尔.肖盖提艾克拜尔.安扎尔斯拉甫.艾白新疆石河子大学药学院石河子832000 新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所乌鲁木齐830049 新疆维吾尔医方剂学实验室乌鲁木齐830049 新疆维吾尔自治区维吾尔医医院.国家中医药管理局维医白癜风诊治重点研究室乌鲁木齐830049

目的:探讨土大黄不同乙醇提取物对ECV-304细胞的生长抑制作用。方法:采用HPLC法测定土大黄提取物中蒽醌类成分的含量;采用培养的ECV-304细胞,应用MTT比色法分析其活性;用光学显微镜观察细胞的形态学变化。结果:土大黄95%乙醇提取物总蒽... 详细信息

目的:探讨土大黄不同乙醇提取物对ECV-304细胞的生长抑制作用。方法:采用HPLC法测定土大黄提取物中蒽醌类成分的含量;采用培养的ECV-304细胞,应用MTT比色法分析其活性;用光学显微镜观察细胞的形态学变化。结果:土大黄95%乙醇提取物总蒽醌成分可充分提取;在0.025～10μg/ml范围内,除水提物外均能明显抑制ECV-304细胞的增值。结论:土大黄95%乙醇提取物中蒽醌类成分的含量及其对ECV-304细胞的抗增殖作用明显优于其他提取物。

关键词：土大黄蒽醌类成分 ECV-304细胞四甲基偶氮唑蓝比色法细胞抑制

氨甲喋呤对映体对急性淋巴细胞白血病细胞株的体外抑制及诱导凋亡的差异研究

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氨甲喋呤对映体对急性淋巴细胞白血病细胞株的体外抑制及诱导凋亡...

作者：张培安徽医科大学

学位级别：硕士

目的：目前在临床治疗急性淋巴细胞白血病（急性B淋巴细胞白血病细胞、急性T淋巴细胞白血病细胞）化疗方案中使用的MTX制剂中存在着单体以及L和D型两种构型不同比例混合现象，D-（-）MTX一直被当成无意义的污染物而被忽视,没有考虑到该... 详细信息

目的：目前在临床治疗急性淋巴细胞白血病（急性B淋巴细胞白血病细胞、急性T淋巴细胞白血病细胞）化疗方案中使用的MTX制剂中存在着单体以及L和D型两种构型不同比例混合现象，D-（-）MTX一直被当成无意义的污染物而被忽视,没有考虑到该药的手性选择性差异的问题。本实验就是比较体外导向不同浓度梯度的氨甲喋呤对映体单体(L-(+)MTX、 D-(-)MTX）及其及其不同比例对映体混合体[(±)MTX]对急性淋巴细胞白血病细胞（BALL-1、CCRF-CEM）的抑制及诱导凋亡的差异。方法：体外导向药物L-MTX、D-MTX及其混合型（D:L=1:9-9:1)作用于淋系白血病细胞,用台盼蓝染色计算药物作用后的死细胞率并在倒置显微镜下观察药物作用下的细胞形态变化;EB-AO双重荧光染色在荧光显微镜下药物作用下的观察细胞染色情况;应用MTT比色法分析其对细胞的抑制率绘制抑制曲线图并计算IC50值,比较不同MTX对映体（L-MTX/D-MTX）及其混合型对增殖淋系白血病细胞的增殖的抑制作用;碘化丙啶(P I)单染流式细胞术检测药物作用后的细胞周期以及凋亡峰变化情况,比较不同MTX对映体（L-MTX/D-MTX）及其混合型对增殖淋系白血病细胞的DNA合成的抑制作用;DNA Ladder测药物作用后的细胞凋亡情况。结果：①L-(+)MTX、D-(-)MTX及混合型能以时间和剂量依赖方式抑制BALL-1细胞和CCRF-CEM细胞的增殖,且得出L-(+)MTX和D-(-)MTX对BALL-1、CCRF-CEM细胞的增殖抑制作用具有化学结构的立体选择性，抑制强度依次为L-(+)MTX>D-(-)MTX，但却低于(±)MTX（D：L=1:9、D：L=2:8），但(±)MTX在D:L=3:7-1：9范围内抑制强度低于L-(+)MTX，高于D-(-)MTX;同时可以发现同种药物作用下对BALL-1的杀伤力高于CCRF-CEM;同时得出L-（+）MTX-CCRF-CEM/BALL-1、D-（-）MTX-CCRF-CEM/BALL-1的24h-IC50值（umol/L)分别为143.36±1.96,80.02±2.24，169.67±2.72，103.78±2.10，48h-IC50值（umol/L)分别为20.76±1.16，58.17±1.98，34.13±1.24，96.78±2.05，72h-IC50值（umol/L)分别为2.21±0.31，11.28±1.40，4.05±0.74，19.57±1.62，且差异有统计学意义（P<0.05)。②L-(+)MTX、D-(-)MTX及混合型(1μmol.L-1)能诱导BALL-1细胞和CCRF-CEM细胞发生坏死、凋亡,倒置显微镜和荧光显微镜观察不同浓度组，不同时间作用下，出现细胞体积变小、核固缩、核染色质浓集等不同程度的形态学改变,并且通过DNA Ladder测细胞凋亡发现D-(-)MTX凋亡梯度弱于L-(+)MTX及混合型(D:L=1:9，1μmol.L-1)且BALL-1药物作用后的凋亡梯度强于CCRF-CEM;(3)体外导向药物L-(+)MTX、D-(-)MTX及其混合型对BALL-1细胞和CCRF-CEM细胞对细胞周期产生抑制作用。表明氨甲喋呤单一体及其不同比例对映体对BALL-1和CCRF-CEM细胞的增殖和DNA合成有抑制作用，两种细胞的细胞周期均发生G0/G1期所占比例下降，S期所占比例上升，G2/M期的比率明显下降。结论：1.L-(+)MTX的抗BALL-1和CCRF-CEM细胞增殖作用明显强于D-(-)MTX，弱于MTX对映体混合体（1:9-2:8），后者具有协同作用，且BALL-1对药物的耐受力强于CCRF-CEM。2.除了细胞毒性作用外，MTX对映体及其混合体可能是通过细胞周期的改变影响对CCRF-CEM和BALL-1有杀伤作用并引起细胞凋亡的。

关键词：氨甲喋呤对映体急性B淋巴细胞白血病细胞急性T淋巴细胞白血病细胞四甲基偶氮唑蓝比色法流式细胞术

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氨甲喋呤对映体对细胞的抑制作用及机制研究

氨甲喋呤对映体对细胞的抑制作用及机制研究

作者：郭立方兰州大学

学位级别：硕士

1.探讨氨甲喋呤对映体((+)MTX、(-)MTX)对ECV304,A549, HepG2细胞的增殖抑制作用及诱导凋亡实验研究。 2.快速灵敏的液相色谱串联质谱法测定氨甲喋呤对映体作用HepG2后,药物在细胞内外液中的浓度。方法 1.采用培养的ECV304, HepG2, A54... 详细信息

1.探讨氨甲喋呤对映体((+)MTX、(-)MTX)对ECV304,A549, HepG2细胞的增殖抑制作用及诱导凋亡实验研究。 2.快速灵敏的液相色谱串联质谱法测定氨甲喋呤对映体作用HepG2后,药物在细胞内外液中的浓度。方法 1.采用培养的ECV304, HepG2, A549细胞,应用MTT比色法分析MTX对映体的活性。 2.用倒置显微镜观察ECV304, HepG2, A549细胞的形态学变化。 3.碘化丙啶(PI)单染流式细胞术检测ECV304, HepG2, A549的细胞周期。 4.荧光显微镜DAPI观察A549细胞的形态学变化及凋亡。 ***梯度电泳检测细胞凋亡。 6.异硫氰酸荧光素／碘化丙啶(V-FITC／PI)双染流式细胞术检测HepG2凋亡 7.液相色谱串联质谱法测定MTX对映体在细胞内外液中的浓度。结果 1.在0.1,umol·L-1-150μmol·L-1范围内,(+)MTX和(-)MTX作用于ECV304, HepG2,A549细胞24、48、72h,均抑制细胞ECV304, HepG2, A549增值,但抑制强度为(+)MTX>(-)MTX。 2.倒置显微镜观镜察不同浓度(+)MTX和(-)MTX作用ECV304, HepG2, A549细胞不同时间后,出现细胞不同程度的形态学改变,且(+)MTX作用的细胞形态学改变强于(-)MTX。 3.(+)MTX和(-)MTX作用ECV304, HepG2和A549细胞,PI单染流式细胞术检测ECV304, HepG2, A549细胞周期的影响,表明氨甲喋呤对映体均干扰ECV304, HepG2,A549细胞DNA合成且出现不同程度的凋亡峰。 4.荧光显微镜DAPI染色察不同浓度(+)MTX和(-)MTX作用A549细胞不同时间后,出现细胞不同程度的形态学改变,有凋亡小体产生。 ***梯度电泳检测结果发现MTX作用组有凋亡条带出现,其中(+)MTX最为明显。 6.(+)MTX和(-)MTX作用HepG2细胞后,细胞出现不同程度的凋亡。 7.(+)MTX和(-)MTX作用HepG2细胞后,测得(+)MTX在细胞内浓度高于(-)MTX。结论 (+)MTX和(-)MTX作用ECV304, HepG2, A549细胞后,能够诱导细胞凋亡,且(+)MTX和(-)MTX对ECV304, HepG2, A549细胞的抗增殖作用具有化学结构的立体选择性,(+)MTX的抗细胞增殖作用明显强于(-)MTX。

关键词：氨甲喋呤对映体药物 ECV304细胞 A549细胞 HepG2细胞四甲基偶氮唑蓝比色法流式细胞术 DNA梯度电泳液相色谱串联质谱