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四季秋海棠BsUFGT基因克隆及功能验证

农业生物技术学报 2023年第10期31卷 2087-2097页

作者：陈敏刘静刘至柔张艳文李逸菲李永华张开明河南农业大学风景园林与艺术学院

四季秋海棠(Begonia semperflorens)是重要的园林观赏植物，其花朵成簇开放，花色艳丽。为了研究四季秋海棠花色形成机理，本研究根据前期获得的四季秋海棠转录组数据，克隆花青素合成途径的关键酶UDP-葡萄糖：类黄酮糖基转移酶(UDP-gly... 详细信息

四季秋海棠(Begonia semperflorens)是重要的园林观赏植物，其花朵成簇开放，花色艳丽。为了研究四季秋海棠花色形成机理，本研究根据前期获得的四季秋海棠转录组数据，克隆花青素合成途径的关键酶UDP-葡萄糖：类黄酮糖基转移酶(UDP-glycose:flavonoid glycosyltransferase, UFGT)基因，通过荧光定量PCR技术检测其在四季秋海棠不同组织中的表达量，并将其转化烟草(Nicotiana tabacum’NC89’)进行功能验证。结果显示，成功克隆了1条cDNA全长为1 536 bp、编码511个氨基酸的基因序列，将其命名为BsUFGT (GenBank No. OL329828)。BsUFGT相对分子量为56 385.34 D，理论等电点(pI)为5.25，含有UDPGT结构域，定位于细胞膜及细胞核中。qRT-PCR分析显示，四季秋海棠花中的BsUFGT表达量显著高于叶和茎的表达量(P四季秋海棠花青素苷合成的分子调节机制提供了理论依据。

关键词：四季秋海棠花青素苷类黄酮糖基转移酶(UFGT)

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四季秋海棠花色苷相关基因的克隆及功能验证

四季秋海棠花色苷相关基因的克隆及功能验证

作者：刘静河南农业大学

学位级别：硕士

四季秋海棠（Begonia semperflorens）秋海棠科秋海棠属,多年生常绿草本花卉。因其四季开花,红花绿叶且观赏期较长,栽培管理方便,对土壤和气候的适应性很强,多用于街道及园林绿化。在观赏植物中,花色是最重要的品质性状之一,花朵颜色基... 详细信息

四季秋海棠（Begonia semperflorens）秋海棠科秋海棠属,多年生常绿草本花卉。因其四季开花,红花绿叶且观赏期较长,栽培管理方便,对土壤和气候的适应性很强,多用于街道及园林绿化。在观赏植物中,花色是最重要的品质性状之一,花朵颜色基本是由花青素苷决定,花青苷是使植物花朵呈现不同颜色的主要物质,其产生的颜色范围是从红色到紫色,包括蓝色。本研究以四季秋海棠（Begonia semperflorens）‘超级奥林匹克’绿叶红花品种为材料,克隆和分析了两个花色苷结构基因DFR、UFGT,对这两个基因调控四季秋海棠花色形成机理进行研究,主要研究成果如下:1.克隆得到四季秋海棠DFR基因,命名为BsDFR（OL329827）。BsDFR长度为1020 bp,共编码339个氨基酸,相对分子质量38122.76,理论等电点p I值为5.91,总原子数为5331,属于稳定的亲水性蛋白;在二级结构预测中发现α-螺旋和无规则卷曲分布较多。BsDFR编码蛋白为非跨膜蛋白且没有信号肽的特征,推测其为非分泌型蛋白。保守结构域分析显示BsDFR基因编码的DFR蛋白含有属于PLN02650超基因家族的二氢黄酮醇4-还原酶结构域,NADB-Rossmann super family保守结构域以及底物特异性结合结构域。BsDFR蛋白属于双子叶型DFR类型在类黄酮生物合成途径中参与催化还原二氢黄酮醇生成无色花青素。系统进化树分析发现BsDFR与葡萄Vv DFR亲缘关系最近。亚细胞定位分析结果显示BsDFR-GFP定位于细胞质。2.克隆得到四季秋海棠UFGT基因,命名为BsUFGT（OL329828）。BsUFGT长度为1536 bp,共编码511个氨基酸,相对分子质量56385.34,理论等电点p I值为5.25,总原子数为7920,属于不稳定蛋白;总平均疏水指数为-0.122,属于亲水蛋白。二级结构预测中发现α-螺旋和无规则卷曲分布较多。BsUFGT编码蛋白为非跨膜蛋白且没有信号肽的特征,推测其为非分泌型蛋白。结构域分析显示BsUFGT基因是UDPGT超家族（superfamily）成员,其编码的UFGT蛋白位于275-441处具有一个UDPGT结构域,具有UDP-黄酮糖基转移酶glycosyltransferase Yji C特征区域。系统进化树分析发现BsUFGT与油橄杭亲缘关系最近。亚细胞定位分析结果显示BsUFGT-GFP主要定位于细胞膜和细胞核中。3.四季秋海棠绿叶、红茎、花苞与盛花中花色苷含量逐渐升高,盛花中花色苷含量最高。BsDFR、BsUFGT在以上组织中具有不同的转录表达水平,呈现逐渐上升的趋势。结合四个组织中的花色苷含量分析,表明四季秋海棠BsDFR、BsUFGT的转录表达与花色苷含量呈正相关。4.构建BsDFR和BsUFGT过表达载体并通过农杆菌介导的叶盘转化法异源转化烟草（Nicotiana tabacum‘NC89’）进行基因功能验证。以烟草Nt Tub A1内参基因为对照,半定量结果显示烟草Nt Tub A1内参基因在野生型和转基因株系均正常表达,BsDFR和BsUFGT基因在转基因烟草株系中可正常表达,但在野生型株系中不表达,且转基因烟草的条带亮度都强于野生型,说明BsDFR和BsUFGT基因在烟草株系中成功转录表达。以野生型烟草为对照,BsDFR和BsUFGT转基因烟草花冠颜色转变为深红色,且BsDFR转基因烟草与BsUFGT转基因烟草花冠颜色变红显著。高效液相色谱（HPLC）法测定烟草花冠花色苷成分和含量,BsDFR和BsUFGT转基因烟草花冠花色苷成分无新增,且与野生型烟草花色苷主要成分均为矢车菊素-3-O-芸香糖苷。与野生型相比,BsDFR和BsUFGT转基因烟草在矢车菊素-3-O-芸香糖苷含量上有显著差异。实时定量qPCR分析表明,BsDFR和BsUFGT转基因烟草花冠中,除类黄酮3’5’羟化酶（F3’5’H）基因表达量较低,其它花色苷生物合成途径的基因表达均产生不同幅度的上调,尤其是花色苷生物合成途径下游基因的表达强度显著高于野生型烟草。

关键词：四季秋海棠花青苷二氢黄酮醇-4-还原酶类黄酮糖基转移酶亚细胞定位转基因烟草

四季秋海棠遗传转化体系的建立及BsRbohD基因的功能验证

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四季秋海棠遗传转化体系的建立及BsRbohD基因的功能验证

作者：王瑞博河南农业大学

学位级别：硕士

四季秋海棠(Begonia semperflorens)是一种多年生常绿草本花卉,被广泛用做观赏植物用于造景。四季秋海棠‘超级奥林匹克’是一种绿叶红花品种,但常因外界环境改变,如高光、低温,引起叶色的变化,具体表现为因花色素苷积累而变红。植物NA... 详细信息

四季秋海棠(Begonia semperflorens)是一种多年生常绿草本花卉,被广泛用做观赏植物用于造景。四季秋海棠‘超级奥林匹克’是一种绿叶红花品种,但常因外界环境改变,如高光、低温,引起叶色的变化,具体表现为因花色素苷积累而变红。植物NADPH氧化酶是细胞内ROS产生的主要来源,有研究发现,因为RbohD基因的大量表达促使植物产生大量的活性氧,活性氧的大量积累对植物产生危害,进而激发了植物的应激防御体系。为了探究低温胁迫下四季秋海棠叶片花色素苷合成积累是否与NADPH氧化酶所介导产生的活性氧有关,本研究将前期课题组构好的超表达载体Super-1300-BsRbohD,通过农杆菌花序侵染的方法,分别转化‘哥伦比亚’野生型拟南芥和纯合的T-DNA插入突变体,通过潮霉素(Hyg)抗性筛选和孟德尔遗传定律得到三株单拷贝的纯和过表达株系OE2、OE6、OE19和三株单拷贝的回补株系Compl-RbohD1、Compl-RbohD2、Compl-RbohD3,以野生型拟南芥为对照,进行低温(4℃)处理,检测了野生型,三个过表达株系OE2、OE6、OE19,突变体和三个回补株系Compl-RbohD1、Compl-RbohD2、Compl-RbohD3的超氧阴离子产生速率,过氧化氢含量,花色素苷含量,BsRbohD基因相对表达量以及花色素苷相关结构基因和相关转录调控基因的表达量。此外,目前有关绿叶红花四季秋海棠“超奥”品种遗传转化的研究,鲜有报道。在课题组前期已成功建立四季秋海棠叶片再生体系的基础上,以四季秋海棠BsRbohD基因为外源目的基因,利用根癌农杆菌进行四季秋海棠的遗传转化体系的探索。结果如下:1对于得到的T-DNA插入突变体,通过三引物PCR的方法进行验证,结果证明突变体为纯合突变体,又通过RT-PCR进一步验证了上述突变体所突变基因即AtRbohD基因完全被敲除。2将四季秋海棠BsRbohD基因在拟南芥中异源表达,并通过潮霉素(Hyg)抗性筛选和PCR检测,分别鉴定筛选三个单拷贝的纯合过表达株系OE2、OE6、OE19和三个单拷贝的回补株系Compl-RbohD1、Compl-RbohD2、Compl-RbohD3。3对野生型、突变体三个过表达株系过表达株系OE2、OE6、OE19和回补株系Compl-RbohD1、Compl-RbohD2、Compl-RbohD3八个株系进行低温(4℃)处理,以野生型拟南芥为对照,通过对八个株系超氧阴离子产生速率和过氧化氢含量的测定,分析发现,在CK条件下,过表达株系的ROS水平显著高于野生型,三个回补株系的ROS水平与野生型几乎一致,且显著高于突变体;四季秋海棠BsRbohD基因可以在拟南芥体内异源正常表达,其所控制的NADPH氧化酶功能正常。而在低温处理15D后,八个株系的ROS水平,相较于CK,大大增加,且三个过表达株系的活性氧水平远远高于野生型,三个回补株系的活性氧水平远高于突变体,略高于野生型。说明转入BsRbohD基因后在面对环境改变时正常产生活性氧以应对环境改变,且转基因株系面对环境改变时表现出比野生型更加敏感的现象。4在低温处理前后八个株系的表型图可知,三个过表达株系相较野生型表现出更多的花色素苷积累,三个回补株系的花色素苷积累与野生型无特别大差异,突变体无明显的花色素苷积累现象。对其花色素苷含量进行测定,分析发现,在CK条件下,八个株系的花色素苷含量无显著差异;在低温处理后,三个过表达株系的花色素苷含量显著高于野生型,三个回补株系的花色素苷含量显著高于突变体,且两个回补株系Compl-RbohD1和Compl-RbohD3的花色素苷含量与野生型无显著差异,Compl-RbohD2的花色素苷含量略高于野生型;并且拟南芥花色素苷相关的转录调控基因和花色素苷合成通路上的结构基因在低温胁迫后都表现出了明显的上调,其中三个过表达株系的表达量几乎都显著高于野生型,三个回补株系的表达量显著高于突变体。以上结果说明转BsRbohD基因在拟南芥中正常表达且发挥作用,由BsRbohD基因介导产生的活性氧可以作为信号分子调节花色素苷相关转录调控基因的表达,进而引起花色素苷相关结构基因的表达上调,最终引起花色素苷的合成积累。5在农杆菌GV3101介导的四季秋海棠遗传转化体系中,卡那霉素(Kanarnycin,Kan)对四季秋海棠不定芽分化的筛选压为25mg/l。分别从预培养时间、侵染液浓度、侵染时间和共培养时间4个方面,对四季秋海棠遗传转化体系进行探索。通过对转基因苗DNA分子水平和转录水平的检测,共有两个组合得到了阳性苗,一组是预培养2 D、侵染液浓度OD600=0.7、侵染10 min、共培养4 D,阳性率为11.1%;另一组是预培养1 D、侵染液浓度OD600=0.7、侵染8 min

关键词：四季秋海棠 BsRbohD基因活性氧花色素苷遗传转化体系

四季秋海棠BsMYB62转录因子的功能研究

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四季秋海棠BsMYB62转录因子的功能研究

作者：姚珂心河南农业大学

学位级别：硕士

四季秋海棠(Begonia semperflorens)作为一种多年生草本花卉在园林景观中具有较大的应用价值,但是在生长和繁殖过程中也会面临各种各样的非生物胁迫。目前有关四季秋海棠的研究多集中于栽培繁殖、病虫害防治和生物学特性等方面,关于其... 详细信息

四季秋海棠(Begonia semperflorens)作为一种多年生草本花卉在园林景观中具有较大的应用价值,但是在生长和繁殖过程中也会面临各种各样的非生物胁迫。目前有关四季秋海棠的研究多集中于栽培繁殖、病虫害防治和生物学特性等方面,关于其在逆境胁迫下的分子调控机制、优良性状培育、重要基因的获得及功能研究等方面的报道还较少。四季秋海棠Bs MYB62基因是从转录组数据中筛选的一个与非生物胁迫相关的基因。本研究通过亚细胞定位分析确定了四季秋海棠MYB62蛋白在细胞中的位置;接着通过荧光定量PCR对Bs MYB62基因进行了组织特异性分析;此外,构建了该基因在植物中的过表达载体,通过花序浸染法对拟南芥进行异源转化,最后获得了Bs MYB62基因过表达的转基因纯合拟南芥株系,为后期Bs MYB62基因的功能研究打下基础。本研究相关结果如下:1.分别提取四季秋海棠植株的叶片、根、茎、雄花和雌花部位的RNA进行荧光定量PCR试验,结果显示Bs MYB62基因在四季秋海棠的五个组织部位中都有表达,其中在茎中的表达量最高,其次是根、雌花和雄花,而在叶片中的表达量最低。2.成功获得了四季秋海棠MYB62蛋白的GFP表达载体和作为对照的细胞核Marker蛋白表达载体,使其在烟草叶片中瞬时表达,通过激光共聚焦显微镜观察荧光分布情况,结果发现四季秋海棠MYB62蛋白荧光信号定位在细胞核上。3.构建了Bs MYB62基因的过表达载体,通过农杆菌侵染花序法获得了Bs MYB62过表达的转基因拟南芥株系,最后利用潮霉素抗性培养基筛选到了Bs MYB62过表达的拟南芥T代纯合株系,并将其用于后续基因的功能研究。4.从Bs MYB62转基因拟南芥在萌发期对干旱胁迫的响应中发现,过表达Bs MYB62基因使得转基因拟南芥在干旱胁迫下的长势比野生型拟南芥好,促进了转基因拟南芥种子的萌发、主根以及侧根的生长,显著增强了拟南芥在萌发期间对干旱胁迫的耐受性。对拟南芥幼苗干旱胁迫后发现,相比野生型拟南芥三个Bs MYB62过表达株系的植株受伤害程度较轻。干旱胁迫下各株系的Fv/Fm逐渐降低,胁迫结束后三个过表达株系的Fv/Fm高于野生型拟南芥,这表明Bs MYB62基因能够提高拟南芥的光合潜能与抗胁迫能力。此外,干旱胁迫后,三个过表达株系的叶绿素含量、脯氨酸(Pro)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性都显著高于野生型拟南芥,而丙二醛(MDA)含量却远低于野生型拟南芥。以上结果说明干旱胁迫过程中,转基因株系有较强的活性氧清除能力,使其受干旱胁迫的损伤低于野生型拟南芥,由此可知过表达Bs MYB62基因能够提高转基因拟南芥的抗旱能力。5.通过荧光定量PCR试验发现干旱胁迫下三个过表达株系的Bs MYB62基因相对表达量不断升高,Bs MYB62基因在干旱胁迫下被显著诱导,说明Bs MYB62基因参与了拟南芥的干旱胁迫响应过程。6.通过Bs MYB62转基因拟南芥对盐胁迫的响应试验发现,过表达Bs MYB62基因能够提高拟南芥在盐胁迫下的种子萌发率,促进主根的生长。7.由Bs MYB62转基因拟南芥对低磷胁迫的响应试验发现,过表达Bs MYB62基因提高了拟南芥种子在低磷条件下的萌发率,促进了拟南芥主根,侧根和根毛的生长,由此可知Bs MYB62转基因株系相比于野生型拟南芥可能具有更强的抗低磷胁迫的能力。

关键词：四季秋海棠 BsMYB62转录因子亚细胞定位组织特异性表达非生物胁迫

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农杆菌介导四季秋海棠遗传转化体系建立

东北农业大学学报 2023年第5期54卷 19-27页

作者：李逸菲王瑞博夏惠婷任璞玉赵丹丹秦肖洁李永华张开明河南农业大学风景园林与艺术学院郑州450002

以四季秋海棠‘超级奥林匹克’叶片为外植体,探索愈伤组织对卡那霉素筛选浓度;将外源基因表达载体通过农杆菌介导进行遗传转化,探索优化预培养、侵染液浓度(OD600)、侵染时间和共培养时间。结果表明,卡那霉素最适浓度为25 mg·L^(-1)。... 详细信息

以四季秋海棠‘超级奥林匹克’叶片为外植体,探索愈伤组织对卡那霉素筛选浓度;将外源基因表达载体通过农杆菌介导进行遗传转化,探索优化预培养、侵染液浓度(OD600)、侵染时间和共培养时间。结果表明,卡那霉素最适浓度为25 mg·L^(-1)。将四季秋海棠BsRbohD外源目的基因导入愈伤组织,经转基因植株分子鉴定,共获得两组不同遗传转化条件阳性植株共12株,分别为:预培养2 d、侵染液浓度OD_(600)=0.7、侵染时间10 min、共培养4 d,阳性率为11.1%;预培养1 d、侵染液浓度OD_(600)=0.7、侵染时间8 min、共培养4 d,阳性率为58.8%。研究初步建立农杆菌介导四季秋海棠稳定遗传转化体系,为深入开展分子设计育种与基因组学研究提供技术支持。

关键词：四季秋海棠组织培养外植体遗传转化体系

低温胁迫时四季秋海棠叶片花色素苷组分构成及相关基因表达量

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东北林业大学学报 2022年第6期50卷 57-62,82页

作者：姚珂心王瑞博刘静白雪齐睿刘胜男李永华张开明河南农业大学郑州450002

以四季秋海棠(Begonia semperflorens)为研究对象,选择株高10 cm左右,状态良好、长势一致的幼苗,进行低温胁迫处理(白天15℃、夜晚5℃),其他条件与培养时保持一致,分别在低温胁迫处理0、1、3、6、9、24、48、96、144、264 h时采集叶片... 详细信息

以四季秋海棠(Begonia semperflorens)为研究对象,选择株高10 cm左右,状态良好、长势一致的幼苗,进行低温胁迫处理(白天15℃、夜晚5℃),其他条件与培养时保持一致,分别在低温胁迫处理0、1、3、6、9、24、48、96、144、264 h时采集叶片样品。采用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法从混合叶片样本中提取总RNA,使用反转录试剂盒(Takara)反转录得到cDNA第一条链;按照荧光定量试剂盒(Takara,RR820A)说明书进行实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR);通过实时荧光定量聚合酶链式反应测定花色素苷合成相关结构基因(BsPAL、BsC4H、Bs4CL、BsCHI、BsCHS、BsF3H、BsANS、BsANR、BsLAR、BsUFGT、BsDFR、BsF3′H)和转运基因(BsGST)低温时的表达量。采用高效液相色谱分析法和液相色谱串联质谱(LC-MS-MS)相结合的方法,分析低温处理对四季秋海棠叶片花色素苷组分的影响。结果表明:低温处理后,结构基因和转运基因相对表达水平都显著升高。将高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱串联质谱(LC-MS-MS)相结合,鉴定出四季秋海棠叶片花色素苷的组成成分,包括矢车菊素-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-半乳糖苷。测定了低温不同时间花色素苷各组分的质量分数,引起低温时四季秋海棠叶片变红的主要物质是矢车菊素-3-O-半乳糖苷。

关键词：四季秋海棠低温胁迫花色素苷基因表达

低温胁迫四季秋海棠叶片色素含量与叶色参数相关性分析

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分子植物育种 2022年

作者：姚珂心齐睿王瑞博刘静陈敏刘至柔李永华张开明李卓河南农业大学风景园林与艺术学院

为研究低温胁迫下四季秋海棠（Begonia semperflorens）叶片色素含量与叶色参数的相关性，用分光光度计和色差仪分别测定了叶片的色素含量和叶色参数，同时借助SPSS 22.0软件进行相关性分析，建立线性回归方程。结果表明，低温处理过程... 详细信息

为研究低温胁迫下四季秋海棠（Begonia semperflorens）叶片色素含量与叶色参数的相关性，用分光光度计和色差仪分别测定了叶片的色素含量和叶色参数，同时借助SPSS 22.0软件进行相关性分析，建立线性回归方程。结果表明，低温处理过程中四季秋海棠叶片逐渐变红主要是因为花色素苷含量的显著变化。在日间15℃，夜间5℃，光强200 μmol m;s;条件下，随着时间的增加，叶片中花色素苷含量逐渐升高，叶绿素含量逐渐下降，类胡萝卜素含量呈现先上升后下降，接着又上升并趋于稳定的趋势。叶片的色彩参数与色素含量存在显著相关性，其中色相a;、色泽比H、色度角h和色光值s与花色素苷含量具有显著相关性。以色彩参数为自变量对花色素苷、叶绿素和类胡萝卜素含量建立的回归方程相关系数R都达到0.95以上，说明色彩参数能够充分反映叶片色素含量。研究叶片色彩参数和色素含量之间的关系，可以探究四季秋海棠叶片颜色与色素含量的变化规律提高其观赏价值，同时为彩叶植物的季相应用提供理论依据。

关键词：四季秋海棠叶色参数色素含量回归方程

TaCBF2异源转化四季秋海棠植株的获得与抗寒性鉴定

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TaCBF2异源转化四季秋海棠植株的获得与抗寒性鉴定

作者：陈敏河南农业大学

学位级别：硕士

四季秋海棠(Begonia semperflorens)‘超级奥林匹克’为秋海棠科秋海棠属观赏植物,是一种绿叶红花的多年生常绿草本花卉,因其色彩明艳,在花镜、花坛等园林植物造景方面得到了广泛应用。但因其原产于南美巴西,喜温暖湿润的环境,不耐严寒... 详细信息

四季秋海棠(Begonia semperflorens)‘超级奥林匹克’为秋海棠科秋海棠属观赏植物,是一种绿叶红花的多年生常绿草本花卉,因其色彩明艳,在花镜、花坛等园林植物造景方面得到了广泛应用。但因其原产于南美巴西,喜温暖湿润的环境,不耐严寒,所以四季秋海棠在北方地区的推广和应用受到了一定程度的限制。CBF(CRT/DRE-Binding Factor)转录因子是植物体内一类重要的应答低温的转录因子,其在低温胁迫下能特异性与冷诱导(Cold regulated,COR)基因的启动子中的CRT/DRE顺式作用元件结合,激活和启动一系列抗逆功能基因的表达,促进脯氨酸、糖类、膜稳定蛋白等物质的合成,从而增强植物的抗寒性。为了培育出耐低温的四季秋海棠品种,本研究克隆了东农冬麦1号小麦中的TaCBF2基因,利用p Can G质粒构建TaCBF2的超表达载体,用农杆菌侵染叶盘法,分别将p Can GEGFP-TaCBF2过表达载体和p Can G-EGFP空载体转入野生型四季秋海棠中,通过鉴定和筛选,得到三个过表达株系OE8、OE9、OE24和空载株系。通过测定各株系的相对电导率并结合Logistic方程求出了各个株系四季秋海棠的低温半致死温度。以野生型四季秋海棠和空载株系的四季秋海棠为对照,进行4°C低温处理,检测了野生型,空载和三个过表达株系OE8、OE9、OE24的抗氧化酶活性,代表渗透调节物质的脯氨酸含量和可溶性糖含量,电导率等一系列生理生化指标,测定了TaCBF2基因的的相对表达量以及相关转录调控基因的表达量。结果如下:1.从东农冬麦1号小麦中成功克隆出TaCBF2基因(登录号为AY951945),该基因CDS区长678bp。构建p Can G-EGFP-TaCBF2过表达载体,利用根癌农杆菌介导的遗传转化法使TaCBF2基因在四季秋海棠中实现了稳定表达,并通过卡那(Kan)抗性筛选和PCR检测,分别鉴定筛选三个过表达株系OE8、OE9、OE24和一个空载株系EM。2.取野生型WT、空载EM和三个过表达株系OE8、OE9、OE24五个株系的叶片,测量其在6℃、3℃、0℃、-3℃、-6℃、-9℃、-12℃、-15℃和-18℃的相对电导率,通过拟合Logistic方程求出各个株系四季秋海棠的低温半致死温度为野生型WT-1.9℃、空载EM-2.16℃、OE8-4.51℃、OE9-4.25℃、OE24-4.39℃。结果表明在四季秋海棠中过表达TaCBF2转录因子提高了四季秋海棠的抗寒潜力。3.对野生型WT、空载EM和三个过表达株系OE8、OE9、OE24共五个株系进行4°C低温处理,通过观察低温处理前后五个株系的表型可知,野生型和空载在低温胁迫下表现出严重的失绿状态,而三个过表达株系的受损症状相对较轻。对其叶绿素浓度进行测定,分析发现,在正常条件下,5个株系叶绿素含量差异不显著;但在低温处理15 d时,三个转基因株系叶绿素浓度显著高于野生型和空载,空载EM与野生型WT之间没有显著差异。表明在四季秋海棠中过表达TaCBF2基因可以减弱低温胁迫对叶绿素的破坏程度。4.对野生型WT、空载EM和三个过表达株系OE8、OE9、OE24共五个株系进行4°C低温处理后发现,低温胁迫下各株系的Fv/Fm逐渐降低,胁迫15 d后三个转基因株系的Fv/Fm高于野生型拟南芥,这表明转入TaCBF2基因可以缓解低温对四季秋海棠的最大光化学效率带来的伤害;此外,低温胁迫后,三个过表达株系的抗氧化酶活性(超氧化物歧化酶SOD和过氧化物酶POD)都显著高于野生型和空载植株,表明转入TaCBF2基因能够提高四季秋海棠在逆境中清除活性氧的能力;三个过表达株系的渗透调节物质(脯氨酸Pro和可溶性糖SS)的含量均显著高于野生型和空载植株,表明转入TaCBF2基因能够提高四季秋海棠受胁迫时的渗透调节能力;三个过表达株系的电导率和丙二醛(MDA)含量均低于野生型和空载植株,表明三个过表达株系的生物膜受损伤的程度小于野生型和空载植株。以上结果说明过表达TaCBF2基因能够降低四季秋海棠在低温胁迫下的受损伤程度。5.以处理前的野生型植株为对照,实时定量q PCR分析表明,低温处理过程中各响应低温的基因表达量均产生了不同幅度的上调,尤其三个过表达株系中的各基因的表达量都显著高于野生型和空载植株。以上结果说明转TaCBF2基因在四季秋海棠中可以稳定表达且能响应低温胁迫,可以激活四季秋海棠中的各个与低温胁迫相关的功能基因的表达,进而引起植物体内一系列的抗寒相关物质的合成,最终提高四季秋海棠的抗寒性。

关键词：四季秋海棠 CBF转录因子遗传转化抗寒性鉴定

四季秋海棠炭疽病菌生物学特性及生防因子的筛选

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北方园艺 2021年第10期 66-71页

作者：张宝清翟雅鑫薛丽芳曹挥郝晓娟山西农业大学植物保护学院山西太谷030801 大同煤矿集团有限责任公司园林绿化分公司山西大同037003

以四季秋海棠炭疽病菌(Colletotrichum truncatum)为试验材料,采用菌落生长法和孢子萌发法,研究了不同培养条件对四季秋海棠炭疽病菌菌落生长和孢子萌发的影响;采用生长速率法研究了14种植物提取物对四季秋海棠炭疽病菌的抑制作用,以期... 详细信息

以四季秋海棠炭疽病菌(Colletotrichum truncatum)为试验材料,采用菌落生长法和孢子萌发法,研究了不同培养条件对四季秋海棠炭疽病菌菌落生长和孢子萌发的影响;采用生长速率法研究了14种植物提取物对四季秋海棠炭疽病菌的抑制作用,以期明确该病原菌生物学特性,筛选对其具有抑菌活性的植物提取物,为该病害的防治提供参考依据。结果表明:最适宜该病原菌菌丝生长的温度为25~30℃,pH 7,最适碳源为葡萄糖,最适氮源为硝酸钠和甘氨酸。分生孢子萌发的最适温度是30~35℃,pH 6~7。丁香、石菖蒲、蛇床子提取物在2.0 mg·mL^(-1)浓度下对菌丝生长具有较好的抑制作用,菌丝生长抑制率分别为100%、92%和90%,其它植物提取物抑制率在20%~85%。

关键词：四季秋海棠炭疽病菌生物学特性植物提取物筛选