检索结果-南通市图书馆

作者：徐文婷苏州大学

学位级别：硕士

目的:四型分泌系统(type IV secretion system,T4SS)在病原菌致病机制中发挥关键作用,其通过向宿主细胞内分泌多种效应分子,使宿主细胞生理功能失调,导致疾病的发生。为阐明人粒细胞无形体病(human granulocytic anaplasmosis,HGA)的发... 详细信息

目的:四型分泌系统(type IV secretion system,T4SS)在病原菌致病机制中发挥关键作用,其通过向宿主细胞内分泌多种效应分子,使宿主细胞生理功能失调,导致疾病的发生。为阐明人粒细胞无形体病(human granulocytic anaplasmosis,HGA)的发病机制,本实验应用生物信息学分析,寻找嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum,AP)T4SS潜在效应分子,研究其生物学功能,同时鉴定HGA新型诊断抗原,为HGA的诊断、治疗和预防提供重要的新依据。方法:一.嗜吞噬细胞无形体T4SS潜在效应分子的筛选、原核表达及抗体制备1.筛选AP T4SS潜在效应分子。以AP基因组编码的610个未知功能蛋白为目标,应用生物信息学技术,根据T4SS效应分子共同特点,筛选潜在的效应分子。2.重组蛋白表达。将筛选获得的APH0177、APH0248、APH0261、APH0615、APH0653、APH0812、APH1127及已鉴定的T4SS效应分子Ats-1为实验对象,按各自基因特征设计引物,以AP基因组DNA为模板进行PCR扩增,并克隆入原核表达载体pET28a(+),进行表达和纯化。同时,另一个筛选获得的效应分子APH0215,经PCR扩增后,将aph0215(90-144)和aph0215(77-144)克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,并引入6×His标签,重组质粒转化至表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化。3.抗体制备。将纯化后的蛋白作为免疫原免疫健康ICR小鼠,制备多克隆抗体,免疫印迹方法检测抗体特异性。4.抗APH0215抗体纯化。将aph0215(77-144)克隆至原核表达载体pMAL-c5x,重组质粒转化至表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化,得到MBP-APH0215作为抗原,免疫印迹方法检测抗APH0215抗体的特异性。将纯化的MBP-APH0215蛋白偶联至琼脂糖凝胶,应用亲和层析方法纯化抗APH0215多克隆抗体。二.嗜吞噬细胞无形体T4SS潜在效应分子APH0215的氨基酸序列分析及真核表达1.应用生物信息技术预测T4SS潜在效应分子APH0215生物学活性和亚细胞定位等。2.分子克隆。根据aph0215基因序列设计引物,pcr扩增获得目的基因,克隆入真核表达载体pegfp-n1,获得重组质粒aph0215-pegfp。3.转染和显微镜下观察。将aph0215-pegfp转染至hela细胞,在荧光显微镜下观察aph0215-gfp在细胞内的分布及对细胞形态等其他方面造成的影响。三.鉴定人粒细胞无形体病特异性新型诊断抗原1.免疫印迹方法检测ap种属特异性蛋白(aph0177-aph1127及ats-1)的抗原性。2.应用抗原性较强的aph0812与100份人血清样本进行免疫印迹分析,以已知的ap诊断抗原p44为对照,比较两者的敏感性差异。结果:一.嗜吞噬细胞无形体t4ss潜在效应分子的筛选、原核表达及抗体制备1.应用生物信息技术,成功在ap基因组编码的未知功能蛋白中筛选获得35个t4ss潜在效应分子,包括aph0177、aph0215、aph0248、aph0261、aph0615、aph0653、aph0812、aph1127。2.成功将aph0177-aph1127及ats-1基因(aph0215除外)克隆至pet28a(+)原核表达载体,iptg诱导表达,sds-page检测,分别在35.4kda、13.8kda、12.1kda、14.2kda、15.6kda、25.6kda、33.0kda和27.7kda出现明显蛋白诱导条带。将aph0215(90-144)和aph0215(77-144)两条dna片段成功克隆入pgex-4t-1原核表达载体,并引入6×his标签,iptg诱导表达,在33.4kda和32kda处出现明显蛋白诱导条带。3.将上述克隆表达的蛋白用ni琼脂糖亲和层析纯化,免疫小鼠,制备多克隆抗体,经免疫印迹检测显示,制备的抗体可与效应分子特异性结合且效价较高。4.成功构建pmal-aph0215原核表达载体,iptg诱导表达,在49.9kda处出现明显蛋白诱导条带,将其作为抗原检测aph0215抗血清中抗体特异性,免疫印迹结果显示,制备的aph0215抗体可与mbp-aph0215特异性结合。应用琼脂糖凝胶亲和层析法纯化抗aph0215(77-144)抗体,结果显示获得的抗体特异性强且纯度较高。二.嗜吞噬细胞无形体t4ss潜在效应分子aph0215的氨基酸序列分析及真核表达1.生物信息学对aph0215氨基酸序列进行分析,结果显示aph0215主要表达于溶酶体。2.成功构建真核表达载体aph0215-pEGF

关键词：嗜吞噬细胞无形体四型分泌系统效应分子抗体诊断抗原

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农杆菌T-复合物的形成与转运研究进展

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生物化学与生物物理进展 2009年第11期36卷 1408-1414页

作者：郭敏亮高佃坤金英善扬州大学生物科学与技术学院扬州225009

在简要介绍农杆菌T-DNA转运全过程的基础上,结合作者近年的工作,重点对T-复合物的形成和T-复合物在农杆菌细胞内的转运机理的最新进展进行归纳和评述.农杆菌能够将其Ti质粒上的一段DNA以单链DNA-蛋白质复合物(简称T-复合物)的形式,通过... 详细信息

在简要介绍农杆菌T-DNA转运全过程的基础上,结合作者近年的工作,重点对T-复合物的形成和T-复合物在农杆菌细胞内的转运机理的最新进展进行归纳和评述.农杆菌能够将其Ti质粒上的一段DNA以单链DNA-蛋白质复合物(简称T-复合物)的形式,通过其细胞两端的四型分泌系统(typeⅣ secretion system,T4SS)转运到宿主植物中,并使宿主发生遗传转化,因而农杆菌介导的T-DNA转运技术已成为应用最广泛的植物转基因技术,同时,由于转运T-复合物的T4SS也是某些质粒接合转移和许多病源微生物分泌致病效应蛋白的通道,因此,农杆菌T-DNA转运机理的研究受到了广泛的重视和关注,使得这方面的研究进展非常迅速.

关键词：农杆菌 T-复合物四型分泌系统 T-DNA转运

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农杆菌T-复合物招募蛋白的发现和生物学功能鉴定

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江西农业大学学报 2010年第5期32卷 992-996页

作者：郭敏亮扬州大学生物科学与技术学院江苏扬州225009

农杆菌是一种能使部分双子叶植物发生冠瘿瘤病害的病原菌,其致病机理是从自身的Ti质粒上转运一段T-DNA到宿主细胞中,并使宿主细胞发生遗传转化。农杆菌是以蛋白质-单链-T-DNA复合物(简称T-复合物)的形式来转运这段T-DNA。T-复合物是通... 详细信息

农杆菌是一种能使部分双子叶植物发生冠瘿瘤病害的病原菌,其致病机理是从自身的Ti质粒上转运一段T-DNA到宿主细胞中,并使宿主细胞发生遗传转化。农杆菌是以蛋白质-单链-T-DNA复合物(简称T-复合物)的形式来转运这段T-DNA。T-复合物是通过四型分泌系统(T4SS)转运到宿主细胞中,T-复合物与T4SS之间的识别是由一种被称为T-复合物招募蛋白的蛋白质来完成的。将对农杆菌T-复合物招募蛋白的发现过程和生物学功能鉴定方面的研究进展进行简要评述。

关键词：农杆菌 T-DNA T-复合物招募蛋白四型分泌系统

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流产布鲁菌rfbE和vdtR基因缺失株毒力减弱的分子机制研究

流产布鲁菌rfbE和vdtR基因缺失株毒力减弱的分子机制研究

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作者：尹伊中国农业科学院

学位级别：硕士

布鲁菌是一种兼性胞内寄生的革兰氏阴性菌,根据其表型,可分为光滑型和粗糙型布鲁菌。布鲁菌无经典的毒力因子,其毒力主要体现在宿主细胞内寄生和存活、逃逸宿主免疫应答、抑制细胞凋亡、在宿主体内建立慢性感染的能力。因此,布鲁菌毒力... 详细信息

布鲁菌是一种兼性胞内寄生的革兰氏阴性菌,根据其表型,可分为光滑型和粗糙型布鲁菌。布鲁菌无经典的毒力因子,其毒力主要体现在宿主细胞内寄生和存活、逃逸宿主免疫应答、抑制细胞凋亡、在宿主体内建立慢性感染的能力。因此,布鲁菌毒力基因的鉴定和功能研究具有重要意义。研究表明,光滑型布鲁菌在感染过程中,小部分布鲁菌可自发突变为粗糙表型并诱导巨噬细胞死亡,该特征对于布鲁菌在细胞间扩散和再感染至关重要。但粗糙型布鲁菌感染致死细胞的分子机制目前并不完全清楚。在本研究中,我们以布鲁菌rfbE基因缺失株(粗糙型布鲁菌突变株,以下称为RB14株)为模式菌株,探讨粗糙型布鲁菌感染致死巨噬细胞的分子机制。首先,验证了 RB14感染致死巨噬细胞依赖于布鲁菌Ⅳ型分泌系统(T4SS)。为进一步验证巨噬细胞死亡依赖于布鲁菌T4SS结构组分还是分泌活性,我们构建了两个仅影响T4SS分泌活性,而不影响T4SS组分表达的T4SS VirB4和VirB11 ATP结构域突变株用于研究。细胞毒性分析表明,RB14诱导的巨噬细胞死亡依赖于T4SS的分泌活性。在进一步研究中,我们使用过表达和转染方法评估了15个已报道的T4SS效应蛋白在细胞毒性中的作用,结果表明,15个效应蛋白过表达株均无细胞毒性。此外,选取其中的10个效应蛋白单独转染或五个效应蛋白共转染均无细胞毒性,结果预示,已报道的15个效应蛋白与RB14感染致死巨噬细胞无关。我们还评估了内质网压力应激IRE1α通路、Txnip-和Caspase-2蛋白在RB14诱导巨噬细胞死亡中的作用。结果表明,IRE1α激活、Caspase和Caspase-2激活与RB14感染致死巨噬细胞无关。同时,RB14感染casp2和txnip基因敲除细胞与亲本细胞相比呈现相似的致死特性。总之,RB14感染致死巨噬细胞依赖于T4SS的分泌活性,且与巨噬细胞IRE1α、Txnip、Caspase-2介导的信号通路无关。在前期研究中,我们新发现一个流产布鲁菌DeoR家族转录调控子与细菌毒力相关,将该基因命名为vdtR基因。在本研究中,我们成功构建了流产布鲁菌vdtR基因缺失株ΔvdtR和原位回复株△vdtR-Rev。基本表型分析发现,vdtR缺失不影响布鲁菌LPS结构和生长特性;耐受性试验发现,vdtR缺失不影响布鲁菌抵抗氧化应激、氮化应激、阳性杀菌肽和自然血清的杀伤。细胞感染试验发现,ΔvdtR缺失株显著减弱胞内存活能力,间接免疫荧光试验分析发现,△vdtR缺失株显著减弱布鲁菌逃逸溶酶体降解及转运至内质网形成成熟复制小体的能力。动物感染试验发现,ΔvdtR缺失株感染小鼠的脾脏载菌量显著低于野生株,预示VdtR在布鲁菌感染致病过程中发挥重要的调控作用。为探讨其调控的分子机制,后续研究中我们基于细菌转录组学比较分析野生株和△vdtR缺失株差异转录基因。经qPCR验证发现,VdtR调控7个关键靶基因的表达,包括BABS27025-55基因簇6个基因和BABS27060基因,RT-PCR分析发现BABS27025-55基因簇具有共转录现象。之后,通过LacZ报告基因分析启动子活性显示,仅BABS27055基因启动子依赖于VdtR蛋白的表达,结果预示,VdtR蛋白通过调控BABS27025-55基因簇同一操纵子发挥调控作用。为验证VdtR的直接调控作用,我们通过EMSA试验分析发现,VdtR蛋白可以直接结合BABS27055基因的启动子区。为进一步探讨VdtR的功能,在布鲁菌胞内感染状态下基因转录分析发现,BABS27025-55基因簇呈现显著的下调表达,且验证了胞内布鲁菌基因簇的表达同样依赖于VdtR蛋白,vdtR缺失后,布鲁菌BABS27025-55基因簇不能被抑制表达,呈现整体上调表达的趋势。综上所述,VdtR在调控布鲁菌致病过程中发挥重要作用,与布鲁菌逃逸溶酶体降解,形成成熟复制小体相关,发现了其抑制表达的关键基因簇,预示该基因簇参与的代谢在布鲁菌胞内存活中发挥重要作用。本研究为布鲁菌致病机制研究提供新思路。

关键词：粗糙型布鲁菌四型分泌系统调控子致病机制

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噬肺军团菌编码的泛素连接酶的生物化学性质及生物学功能研究

噬肺军团菌编码的泛素连接酶的生物化学性质及生物学功能研究

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作者：葛建宁中国协和医科大学

学位级别：硕士

噬肺军团菌(Legionella pneumophila)在感染宿主细胞过程中，能够干扰宿主细胞的膜泡运输体系，募集包括源于内质网的光滑膜泡、线粒体和核糖体等细胞器，并逃避吞噬泡的成熟过程，避免与溶酶体的融合降解，随后在经过修饰的吞噬泡内复... 详细信息

噬肺军团菌(Legionella pneumophila)在感染宿主细胞过程中，能够干扰宿主细胞的膜泡运输体系，募集包括源于内质网的光滑膜泡、线粒体和核糖体等细胞器，并逃避吞噬泡的成熟过程，避免与溶酶体的融合降解，随后在经过修饰的吞噬泡内复制增殖并裂解宿主细胞，进而导致疾病的产生。噬肺军团菌的Dot／Icm四型分泌系统对于其对宿主细胞内的感染非常重要，该四型分泌系统突变的噬肺军团菌进入宿主细胞后所形成的吞噬泡很快经内体成熟途径与溶酶体融合而被降解。Dot／Icm系统可以分泌许多细菌效应蛋白进入宿主细胞内，但是目前对这些效应蛋白还知之甚少。本课题通过对噬肺军团菌基因组数据的生物信息学分析，我们发现噬肺军团菌基因组编码的3个蛋白Lpg2830、Lpg2144和Lpg0171分别含有真核细胞所特有的U-Box(Lpg2830)和F-Box(Lpg2144和Lpg0171)结构域，这两个结构域均广泛存在于真核细胞的泛素系统中，能够单独或与其它细胞成分形成复合物催化泛素修饰反应。在此，通过实验我们验证了Lpg2830在体内体外均拥有泛素连接酶的活性，可以利用UbcH5进行自泛素化修饰，Lpg2144与Lpg0171均能够形成SCF复合物，SCF复合物在真核细胞中能够将底物泛素化修饰并被蛋白酶体识别降解。Lpg2830、Lpg2144与Lpg0171均能够通过四型分泌系统进入宿主细胞，它们通过各自C端的不同定位信号定位于特定的细胞结构，在Cos7细胞中Lpg2830与Lpg0171定位于核周内质网结构，而Lpg2144则定位于细胞质膜上，尽管分别缺失这三个基因对于噬肺军团菌的胞内生长并没有明显影响，但是以上数据表明它们极可能通过干预或者模拟宿主细胞的泛素修饰体系来协助噬肺军团菌在宿主细胞内的生存与复制。

关键词：噬肺军团菌泛素吞噬泡四型分泌系统效应蛋白

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农杆菌vbp基因表达调控分子机理的研究

农杆菌vbp基因表达调控分子机理的研究

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作者：吴萧扬州大学

学位级别：硕士

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一种栖生于土壤中的革兰氏阴性植物病原菌。在自然条件下,它具有趋化性,能感受创伤植物产生的酚类物质,使植物受伤部位产生冠瘿瘤疾病。其Ti (Tumor inducing)质粒上的一段DNA序列(T-DNA)以单链... 详细信息

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一种栖生于土壤中的革兰氏阴性植物病原菌。在自然条件下,它具有趋化性,能感受创伤植物产生的酚类物质,使植物受伤部位产生冠瘿瘤疾病。其Ti (Tumor inducing)质粒上的一段DNA序列(T-DNA)以单链DNA-蛋白质复合物(简称T-复合物)的形式,通过其细胞两端的四型分泌系统(type IV secretion system, T4SS)转移并整合在宿主植物细胞的染色体中,随着宿主的基因组进行遗传转化。这种具有天然转基因功能的质粒上的T-DNA被外源DNA取代后,农杆菌仍然可以把外源的T-DNA转移到宿主植物中,使宿主发生遗传转化,因而农杆菌介导的T-DNA转运技术已经成为应用最为广泛的植物转基因技术。有许多蛋白都参与了农杆菌的T-DNA的转运过程,而且最新鉴定出了一种能与VirD2蛋白结合的蛋白质(VirD2-Binding Protein,简写VBP),证明该蛋白起着招募T-复合物至T4SS附近的作用,因而被命名为农杆菌T-复合物招募蛋白。在农杆菌中存在三个同源基因,分别命名为vbpl, vbp2和vbp3,它们可以编码出三种同源蛋白VBP1, VBP2和VBP3。尽管VBP的生物学功能已经确定,但是,它的生物化学功能还不明确。为了使农杆菌T-复合物招募蛋白VBP的研究,能够从基因的生物学功能到蛋白质的生物化学功能再到表达调控形成完整系统的研究,本实验就是开展VBP蛋白表达调控机理的研究,寻找vbp基因调控区的结合蛋白,并研究这些潜在的结合蛋白调控vbp基因表达的机理。以探讨是否可以通过提高VBP蛋白在农杆菌细胞内的表达量的方法来提高T-DNA的转化效率。本实验先用分子生物学的方法来寻找vbp基因调控区的结合蛋白：因为我们购买的磁珠(Dynabeads(?) M-280Streptavidin)的表面带有一层生物素结合蛋白,通过对vbp基因的上游序列进行生物素标记,使得磁珠与生物素化的DNA紧紧结合在一起,然后将DNA磁珠复合体与经诱导培养的农杆菌C58菌株的细胞破碎蛋白上清液结合,然后将目的蛋白洗脱下来,进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,找出与对照有差别的条带,切下来进行质谱检测。从检测到的蛋白成分中,没有发现对基因表达调控有意义的蛋白质;所以转向生物信息学的方法来研究vbpl基因的表达调控机理,通过原核生物启动子分析的相关网站,初步检索出能够调控vbpl基因的转录调控因子sigmaA、Fnr、 tgntataat、sigma38和crp,找到它们在vbpl基因启动子上的结合位点,确定vbpl基因启动子的大小。先将pRSET-A质粒的启动子去除构成空载体质粒,再插入带有荧光蛋白基因标记的vbp1基因启动子序列,构建pRSET-avg重组表达质粒。在荧光显微镜下,从菌液中可以看到绿色荧光,说明在这几个转录调控因子调控下,vbp1启动子在pRSET-avg重组表达质粒中可以正常启动荧光基因表达。接下来再对这些转录调控因子结合位点的碱基序列进行分析,构建三个突变的重组表达质粒pRSET-m1、pRSET-m2和pRSET-m3,在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况,分析这些转录因子的结合位点突变后vbp1启动子是否仍然可以启动荧光基因的表达。结果发现将sigmaA结合位点去除后会削弱vbp1启动子启动荧光基因的表达,将Fnr、tgntataat、sigma38和crp这几个转录调控因子结合位点的相同的碱基进行两种突变后,一种突变可以增强vbp1启动子启动荧光基因的表达,而另一种突变使vbp1基因启动子不能启动荧光基因的表达。由此可以看出,对vbp1基因启动子上的某个碱基进行突变后会提高VBP1蛋白的表达量,从而提高了农杆菌T-DNA转运效率。

关键词：农杆菌T-复合物招募蛋白四型分泌系统启动子转录因子

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布鲁氏菌VirB8-PCR诊断方法的建立与应用及Ery基因的克隆与序列分析

布鲁氏菌VirB8-PCR诊断方法的建立与应用及Ery基因的克隆与序列分...

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作者：吴冬玲新疆农业大学

学位级别：硕士

根据布鲁氏菌病致病力因子-四型分泌系统中的VirB8基因序列,设计引物,建立了检测布鲁氏菌病的PCR方法,用于布病的早期诊断和致病力因子的检测。对布鲁氏菌标准株、疫苗株及新疆分离株的分析检测结果表明,VirB8-PCR检测方法与分菌实验符... 详细信息

根据布鲁氏菌病致病力因子-四型分泌系统中的VirB8基因序列,设计引物,建立了检测布鲁氏菌病的PCR方法,用于布病的早期诊断和致病力因子的检测。对布鲁氏菌标准株、疫苗株及新疆分离株的分析检测结果表明,VirB8-PCR检测方法与分菌实验符合率为100%,特异性在90%以上,敏感性为153fgDNA(相当于30个菌)。该方法重复性和稳定性好,预混液-20℃保存期6个月以上。此外,本实验对7株布鲁氏菌VirB8基因进行了克隆测序,同源性在99.3%以上,该结果表明VirB8基因片段是一段高度保守序列,对于布鲁氏菌病的检测结果比较准确、可靠。本实验还采用虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、iELISA、cELISA和PCR方法对4个养殖场的1354只家畜(713头牛,641只羊)进行了布病检测,其中牛阳性率为30.2%,羊阳性率为19.7%,检测结果表明布病的发病率呈明显上升趋势。用选择性培养基对采集样品进行细菌分离培养,同时利用VirB8-PCR对布病可疑菌落(49个)进行检测并鉴定,判定13个菌落为布鲁氏菌。经AMOS-PCR鉴别,其中12株为牛型;1株为羊型,经生化鉴定为羊Ⅲ型。国际标准S19株的赤藓醇代谢基因(Erythritol catabolic gene,简写Ery)缺失702 bp,而我国的A19株具有完整的Ery基因。参照GenBank中布鲁氏菌牛种2308的Ery基因序列,设计一对特异性引物,以国际标准参考株S19,中国天康疫苗株A19-1,中国中监所标准株A19-2的DNA为模板,扩增不同来源的3株19号疫苗株的Ery基因,并对PCR产物进行克隆、测序分析。与2308的Ery基因比较,S19的Ery基因缺失702碱基,两株中国来源的A19株不缺失,但该基因阅读框的3个碱基发生了改变,即51,52位CG变为GC ,521,522,523位缺失AGG,547位T变为C。由此而引起3个氨基酸发生了变化,即13位精氨酸(Arg)变为丙氨酸(Ala),170位苏氨酸(Thr)变为丙氨酸(Ala),178位缬氨酸(Val)变为丙氨酸(Ala)。

关键词：布鲁氏菌病四型分泌系统 PCR 诊断序列分析

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