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生物工程学报 2024年

作者：张绥欣郑小迪倪鹏汪众刘彪汪洋胡翰刘滨磊湖北工业大学生命科学与健康工程学院武汉滨会生物科技股份有限公司

为研究Ⅱ型单纯疱疹病毒gd胞外域(ectodomain)为免疫原的circRNA疫苗诱导BALB/ c小鼠出现的特异性免疫反应，并进行免疫研究评价，为单纯疱疹病毒mRNA疫苗的研发提供实验依据和技术参考。本研究通过PCR技术和同源重组技术，从pT7AMP-gd ... 详细信息

为研究Ⅱ型单纯疱疹病毒gd胞外域(ectodomain)为免疫原的circRNA疫苗诱导BALB/ c小鼠出现的特异性免疫反应，并进行免疫研究评价，为单纯疱疹病毒mRNA疫苗的研发提供实验依据和技术参考。本研究通过PCR技术和同源重组技术，从pT7AMP-gd ectodomain质粒中获得gd基因，将gd基因克隆至pUC57载体，获得重组pUC57-circ-gd质粒并进行测序鉴定。进行PCR获得后续实验模板DNA后以单纯疱疹病毒囊膜糖蛋白gd ectodomain为免疫原，并同时将模板DNA进行IVT(in vitro transcription， IVT)及环化，将得到的pUC57-circ-gd mRNA进行RNase R酶酶切验证、反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction， RT-PCR)成环验证，确定是否成环；转染293T细胞，72 h后收集细胞上清，进行蛋白免疫印迹法(western blotting， WB)的蛋白表达鉴定；脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles， LNP)对合成的mRNA采用微流控包封法进行包封；包封后，将其应用于模型动物BALB/ c小鼠中实验，在第21、35 d于眼底静脉丛采血，第49 d麻醉后摘除眼球采血，后续进行酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)抗体检测及对病毒中和抗体进行测定，并在49 d取脾脏，后续通过固相酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot， ELISpot)检测来评估细胞因子IFN-γ的分泌情况。成功构建重组质粒，测序结果正确；RNase R酶切验证后证实了环状RNA的存在，mRNA转染293T细胞后western blotting验证有清晰的特异性条带；对疫苗进行质量检测，通过尺寸排阻高效液相色谱法(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography， SEC-HPLC)检测到疫苗的纯度约为90%，测量mRNA-LNP的粒径为82.76 nm，包封率达到98%左右；小鼠进行3次免疫后，小鼠体重的上升及存活率证实了疫苗的安全性；免疫后检测发现在免疫后的小鼠血清中，IgG抗体滴度增加；在脾脏细胞中，检测到分泌特异性IFN-γ的T细胞数量升高。后续ELISA、中和抗体检测、ELISpot实验及攻毒实验说明pUC57-circ-gd mRNA免疫原性及持久性良好，并且可以抵御病毒的攻击。本研究能够为circRNA疫苗相关研究提供参考。

关键词： Ⅱ型单纯疱疹病毒囊膜糖蛋白gd ectodomain基因环状RNA mRNA疫苗免疫原性

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