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人源细粒棘球蚴囊壁与囊液中宿主蛋白的鉴定与分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2023年第6期41卷 677-682页

作者：李涛李子华张翠影赵巍宁夏医科大学总医院银川750004 宁夏医科大学基础医学院银川750004 宁夏医科大学科学技术研究中心银川750004 宁夏常见传染病重点实验室银川750004

目的通过对细粒棘球蚴囊壁及囊液中的宿主蛋白成分进行鉴定,进一步阐明细粒棘球绦虫与宿主之间相互作用的现象。方法收集2022年宁夏医科大学总医院肝胆外科10例细粒棘球蚴病患者手术摘除的具有活性的完整棘球蚴包囊,同时取患者血样。无... 详细信息

目的通过对细粒棘球蚴囊壁及囊液中的宿主蛋白成分进行鉴定,进一步阐明细粒棘球绦虫与宿主之间相互作用的现象。方法收集2022年宁夏医科大学总医院肝胆外科10例细粒棘球蚴病患者手术摘除的具有活性的完整棘球蚴包囊,同时取患者血样。无菌抽取子囊中无色透明的囊液,离心收集上清液;子囊内壁反复冲洗后剪碎,裂解匀浆,收集上清液。用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒提取囊液和囊壁全蛋白,经过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳后,切取囊壁全蛋白泳道显著的蛋白条带,进行质谱检测,进行蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析。对患者血清和囊液的生化成分浓度进行定量检测。结果10例细粒棘球蚴病患者的肝脏功能为Child-Pugh A或B级。病灶直径为2.9~16.3 cm,为WHO-IWGE分型的CE2(多子囊型)或CE3(内囊塌陷型)。SDS-PAGE电泳分析结果显示,棘球蚴囊壁蛋白在相对分子质量(Mr)为70000、50000、25000处显示出清晰的蛋白条带,囊液蛋白在Mr 70000显示出清晰的蛋白条带。蛋白质谱与Western blotting结果均显示,相对分子质量在约Mr 70000的蛋白中包含人血白蛋白,约Mr 50000的目标蛋白为人IgG重链,约Mr 25000的目标蛋白为人IgG轻链。各生化指标中,囊液和血清中的中K+浓度分别为(5.53±0.86)mmol/L和(3.92±0.33)mmol/L,白蛋白浓度分别为(0.57±0.46)g/L和(39.42±2.77)g/L,胆固醇浓度分别为(0.03±0.02)mmol/L和(3.79±1.53)mmol/L,三者在囊液和血清中的浓度差异有统计学意义(t=5.56、43.71、7.74,P囊壁和囊液中含量较高的宿主蛋白。

关键词：细粒棘球绦虫白蛋白抗体囊壁囊液

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细粒棘球蚴囊液蛋白组分分析

中国血吸虫病防治杂志 2021年第5期33卷 476-482,539页

作者：王舒颖杨小迪高宏宇邢敬雨胡琪黄婷婷吴培赵艺婷刘浩伟刘为玥王会娜周瑞褚亮蚌埠医学院第一附属医院儿科蚌埠233000 安徽省感染与免疫重点实验室蚌埠医学院病原生物学教研室蚌埠医学院第二附属医院普外科

目的利用鸟枪法分析细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)囊液蛋白(hydatid cyst fluid protein,HCFP)组分,寻找其中具有潜在调控免疫失调性疾病功能的活性组分。方法无菌收集细粒棘球蚴病患者肝囊肿中的细粒棘球蚴囊液,采用鸟枪法进行... 详细信息

目的利用鸟枪法分析细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)囊液蛋白(hydatid cyst fluid protein,HCFP)组分,寻找其中具有潜在调控免疫失调性疾病功能的活性组分。方法无菌收集细粒棘球蚴病患者肝囊肿中的细粒棘球蚴囊液,采用鸟枪法进行液相色谱-串联质谱鉴定,采用Max Quant 1.***.1.0软件进行数据库检索。利用基因本体论(Gene Ontol-ogy,GO)对已鉴定的蛋白质从细胞组分、分子功能和生物学功能三个方面进行分类。结果经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离的细粒棘球蚴囊液蛋白条带相对分子量为25~70 k Da,质谱分析共获得37个蛋白,其中已鉴定蛋白32种、未知蛋白5种。已初步发现至少有4种蛋白具有潜在调节免疫失调性疾病作用,即抗原B、谷胱甘肽S-转移酶、硫氧还蛋白过氧化物酶和苹果酸脱氢酶。GO富集分析显示,已鉴定蛋白具有149种分子功能,参与341种生物学过程。结论细粒棘球蚴囊液蛋白成分复杂多样,从已知蛋白中初步筛选出4种与调节免疫失调性疾病潜在相关的蛋白。

关键词：细粒棘球蚴囊液蛋白质组鸟枪法免疫失调性疾病

多房棘球蚴囊液对小鼠肝细胞凋亡与自噬影响的研究

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解放军医学院学报 2022年第1期43卷 81-86,94页

作者：徐凯尹凤娇张耀刚吴传玲李文登任利樊海宁王海久王志鑫青海大学附属医院肝胆胰外科青海西宁810001 青海省包虫病研究重点实验室青海西宁810001 浙江工业职业技术学院鉴湖学院基础医学教研室浙江绍兴312000

背景多房棘球蚴病是一种流行于北半球的人兽共患寄生虫病,由于不能形成完整的“囊壁”,其病灶中的囊液持续外渗,不断刺激宿主肝细胞,使肝细胞出现“丢失”的情况。目的初步探究多房棘球蚴囊液(hydatid cyst fluid,HCF)对小鼠肝AML-12细... 详细信息

背景多房棘球蚴病是一种流行于北半球的人兽共患寄生虫病,由于不能形成完整的“囊壁”,其病灶中的囊液持续外渗,不断刺激宿主肝细胞,使肝细胞出现“丢失”的情况。目的初步探究多房棘球蚴囊液(hydatid cyst fluid,HCF)对小鼠肝AML-12细胞凋亡与自噬的影响。方法CCK-8法筛选合适的HCF浓度后,将小鼠AML-12细胞分为对照组、HCF 0.4 mg/mL组和HCF 0.8 mg/mL组。CCK-8法检测各组小鼠肝AML-12细胞活性(浓度选择);流式细胞术检测小鼠肝AML-12细胞凋亡情况;Western blot法检测DDIT4、Beclin-1、Caspase-3、PCNA、LC3等凋亡自噬相关蛋白的表达情况;单丹磺酰尸胺(monodansyl cadaverine,MDC)法检测细胞自噬的情况,透射电镜下观察HCF对小鼠肝AML-12细胞超微结构的影响。结果CCK-8结果显示24 h、48 h、72 h时0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、3.2 mg/mL、6.4 mg/mL HCF组和48 h、72 h时0.4 mg/mL HCF组的AML-12细胞增殖抑制率均较对照组明显升高(P<0.01);流式细胞计数检测结果显示0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF作用于细胞48 h后细胞凋亡率明显升高(P<0.01);MDC法结果显示0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF作用于细胞48 h后出现大量高亮度类圆形团块,平均荧光强度明显升高(P<0.01);Western blot法检测结果显示,与对照组相比,0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF组DDIT4、PCNA、Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达显著升高(P<0.01);与0.4 mg/mL HCF组相比,0.8 mg/mL HCF组LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达显著升高(P<0.05)。透射电镜下可见对照组细胞质未见明显肿胀,线粒体基质较均匀,嵴少量减少,自噬水平低;0.4 mg/mL HCF组线粒体损伤程度较低,轻微肿胀,嵴少量断裂,胞内可见较多自噬溶酶体;0.8 mg/mL HCF组细胞线粒体损伤程度高,线粒体膜破损、基质外溢,嵴缺失,胞内可见较大面积自噬溶酶体。结论HCF对体外培养的AML-12细胞的增殖有明显抑制作用,DDIT4表达增高,并促进AML-12细胞自噬的发生,诱导细胞凋亡。

关键词：多房棘球蚴囊液小鼠肝细胞细胞凋亡细胞自噬

泡球蚴囊液对大鼠肝星状细胞MAPK信号通路5个相关基因的影响

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2015年第2期33卷 114-117,121页

作者：任宾樊海宁邓勇王海久任利青海大学附属医院肝胆胰外科西宁810001

目的探讨泡球蚴囊液对大鼠肝星状细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路5个相关基因的影响。方法采用大鼠肝星状细胞株HSC-T6与不同蛋白浓度的泡球蚴囊液(0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.9、1.7... 详细信息

目的探讨泡球蚴囊液对大鼠肝星状细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路5个相关基因的影响。方法采用大鼠肝星状细胞株HSC-T6与不同蛋白浓度的泡球蚴囊液(0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.9、1.7、3.4、6.8和13.5 mg/ml)共培养24 h后收集细胞,同时收集对照组(未加泡球蚴囊液干预)细胞,显微镜下观察HSC-T6细胞的形态变化。利用荧光实时定量PCR检测大鼠肝星状细胞的细胞外调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和丝裂原活化蛋白激酶(p38)的表达情况。结果蛋白浓度为13.5 mg/ml泡球蚴囊液与HSC-T6细胞共培养24 h后,大部分细胞发生固缩,呈脱落前兆。6.8 mg/ml囊液组部分细胞固缩,呈脱落前兆;而部分HSC-T6细胞收缩,呈长梭形,细胞生长出许多细长的伪足,是正常状态的2倍以上。3.4 mg/ml囊液组部分细胞呈收缩的长梭形,生长出许多细长的伪足,但大部分细胞仍呈现为贴壁的胞体较大的不规则多边形,且伸出较短的伪足与其他细胞连接成片状。囊液组与对照组细胞形态上无差异。实时荧光定量PCR检测显示,泡球蚴囊液浓度>0.4 mg/ml时,ERK1/2、JNK1/2和p38 m RNA水平显著增加;囊液浓度为6.8 mg/ml时,ERK1/2、JNK1/2和p38 m RNA较对照组高表达(P囊液可显著影响大鼠肝星状细胞ERK1/2、JNK1/2和p38 m RNA水平。

关键词：多房棘球绦虫囊液大鼠肝星状细胞丝裂原活化蛋白激酶

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猪囊尾蚴囊液蛋白组学分析

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2019年第2期37卷 144-149页

作者：庞建达宋伊宁王昕蕊刘明远孙树民内蒙古民族大学动物科学技术学院通辽028000 吉林大学人兽共患病研究教育部重点实验室人兽共患病研究所长春130062

目的利用鸟枪法技术鉴定猪囊尾蚴囊液蛋白组分构成,完善猪囊尾蚴蛋白表达谱,筛选特异性候选诊断标识并分析囊液蛋白组分的功能。方法无菌收集猪囊尾蚴虫体囊液,经处理后采用shotgun液相色谱-串联质谱系统对囊液进行分选与鉴定,通过Masco... 详细信息

目的利用鸟枪法技术鉴定猪囊尾蚴囊液蛋白组分构成,完善猪囊尾蚴蛋白表达谱,筛选特异性候选诊断标识并分析囊液蛋白组分的功能。方法无菌收集猪囊尾蚴虫体囊液,经处理后采用shotgun液相色谱-串联质谱系统对囊液进行分选与鉴定,通过Mascot 2.2软件进行数据库检索,完成蛋白鉴定。使用Blast2go软件对蛋白序列进行比对和注释,对注释的蛋白组分数据进行Gene Ontology (GO)分析。结果经鸟枪法分析共获得486个蛋白,通过Mascot 2.2软件检索已鉴定蛋白为158种,未知蛋白为328种。初步筛选囊液中含有丰度较高的8 kDa糖蛋白、膜联蛋白、烯醇化酶、胰蛋白酶样蛋白等4个猪囊尾蚴特异性抗原和多种酶类,主要存在于细胞及细胞组分中。其中膜联蛋白主要具有结合功能,主要参与一系列依赖于钙离子的膜型生物活动;烯醇化酶主要具有离子结合功能和水解酶活性,除大量富集在糖酵解途径中,还参与调节DNA结合转录因子过程。GO分析结果显示:蛋白谱分布细胞成分方面, 65个蛋白位于细胞中, 64个蛋白位于细胞组分中, 25个蛋白位于细胞器中,其余位于细胞器、蛋白复合物、细胞外区域和细胞膜中;蛋白谱分子功能方面, 72个蛋白具有催化活性, 74个蛋白具有结合功能,其余蛋白具有转运蛋白活性、分子功能调节剂、结构分子活性等功能;生物进程分类方面, 69个蛋白参与细胞进程,73个蛋白参与代谢进程, 11个蛋白参与生物调节、生物过程的调节、信号、对刺激的应答、定位等过程。结论经鸟枪法技术初步筛选出4个丰度较高可作为猪囊尾蚴病诊断标识的候选抗原,鉴定出的酶类可能在猪囊尾蚴与宿主互作过程中起相关作用。

关键词：猪囊尾蚴囊液鸟枪法诊断标识

泡球蚴囊液对调控小鼠肝细胞DDIT4的影响及机制

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泡球蚴囊液对调控小鼠肝细胞DDIT4的影响及机制

作者：徐凯青海大学

学位级别：硕士

目的:1.探究多房棘球蚴囊液(HCF)对小鼠肝AML-12细胞凋亡与自噬的初步研究;2.沉默小鼠肝细胞中DDIT4的表达观察其是否调节凋亡与自噬的变化。方法:1.采用CCK8法筛选合适的HCF浓度后,将小鼠AML-12细胞分为对照组、HCF 0.4 mg/mL组和HCF 0... 详细信息

目的:1.探究多房棘球蚴囊液(HCF)对小鼠肝AML-12细胞凋亡与自噬的初步研究;2.沉默小鼠肝细胞中DDIT4的表达观察其是否调节凋亡与自噬的变化。方法:1.采用CCK8法筛选合适的HCF浓度后,将小鼠AML-12细胞分为对照组、HCF 0.4 mg/mL组和HCF 0.8 mg/mL组。CCK-8法检测各组小鼠肝AML-12细胞的细胞活性(浓度选择);流式细胞术检测小鼠肝AML-12细胞凋亡情况;Western blot法检测DDIT4、Beclin-1、Caspase-3、PCNA、LC3等凋亡自噬相关蛋白的表达情况;单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin,MDC)法检测细胞自噬的情况以及透射电镜下观察HCF对小鼠肝AML-12细胞影响后超微结构的影响。2.使用慢病毒沉默AML-12细胞DDIT4后,在HCF的干预下采用CCK-8法检测各组小鼠肝AML-12细胞的细胞活性;Western blot法检测Beclin-1、Caspase-3、LC3等凋亡自噬相关蛋白水平;Tunel法检测细胞凋亡情况。结果:1.CCK-8结果显示在24、48和72h,0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、3.2 mg/mL和6.4 mg/mL HCF组与对照组比较以及48h和72h后0.4 mg/mL HCF组能明显抑制AML-12细胞的增殖(P<0.01);流式细胞计数检测结果显示0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF作用于细胞48h后细胞凋亡率明显上升(P<0.01);MDC法结果显示0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF作用于细胞48h后出现大量高亮度类圆形团块,平均荧光强度明显增高(P<0.01);Western blot法检测结果显示:与con组相比,0.4mg/mL、0.8mg/mL HCF组DDIT4、PCNA、Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达显著升高(P<0.01);0.8mg/mL HCF组与0.4mg/mL HCF组的LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相比表达升高(P<0.05)。透射电镜下可见:con组胞质未见明显肿胀,线粒体基质较均匀,嵴少量减少,自噬水平低;0.4 mg/mL组线粒体损伤程度较低,轻微肿胀,嵴少量断裂,胞内可见较多自噬溶酶体;0.8 mg/mL组细胞线粒体损伤程度高,线粒体膜破损、基质外溢,嵴缺失,胞内可见较大面积自噬溶酶体。2.在小鼠肝细胞中沉默DDIT4后,在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光强度及被感染细胞数量,荧光细胞占全视野细胞的80%以上。PCR和Western blot结果显示转染后LV-Ddit4-RNAi组中DDIT4基因和蛋白表达水平较LV-Ddit4-NC显著下调(P<0.01)。CCK-8法显示沉默DDIT4后小鼠肝细胞在0.4 mg/mL、0.8mg/mL HCF 48h后作用下增殖能力明显高于LV-Ddit4-NC(P<0.01);显微下观察48h后细胞形态接近正常AML-12细胞形态,多成椭圆形或者圆形,细胞生长密度较LV-Ddit4-NC明显增多;Tunel实验显示沉默DDIT4可明显抑制细胞凋亡的发生(P<0.01);Western blot法检测结果显示,与LV-Ddit4-RNAi con相比,LV-Ddit4-RNAi 0.8mg/mL HCF组Caspase-3表达具有统计学意义(P<0.05);与LV-Ddit4-NC 0.4mg/mL、0.8mg/mL HCF组相比,LV-Ddit4-RNAi 0.4mg/mL、0.8mg/mL HCF组LC3-Ⅱ表达具有统计学意义(P<0.05),Beclin-1、Caspase-3蛋白表达具有统计学意义(P<0.01),具有减轻细胞凋亡的发生。结论:1.HCF对体外培养的AML-12细胞的增殖有明显的抑制作用,DDIT4蛋白表达水平增高,并促进AML-12细胞自噬的发生及诱导细胞发生凋亡。2.通过沉默DDIT4可以促进AML-12细胞在HCF作用后细胞的增殖,并抑制AML-12细胞在HCF作用后凋亡和自噬的产生。

关键词：多房棘球蚴囊液 DDIT4 细胞凋亡细胞自噬

适用于细粒棘球蚴囊液蛋白质组分析的双向电泳技术

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西安交通大学学报（医学版） 2015年第5期36卷 711-714页

作者：李居怡刘巧媚黄文静阮周莹邓艾平武汉市中心医院药学部湖北武汉430021 武汉市第三医院医务处湖北武汉430061 武汉市中心医院内分泌科湖北武汉430021 武汉市中心医院眼科湖北武汉430021

目的建立适用于细粒棘球蚴囊液蛋白质组的双向电泳分离条件。方法冷冻干燥法制备囊液总蛋白提取物,观察不同的蛋白样品处理方法、IPG胶条pH范围和电泳上样量对双向电泳图谱的影响。结果经ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit处理的提取物上样量... 详细信息

目的建立适用于细粒棘球蚴囊液蛋白质组的双向电泳分离条件。方法冷冻干燥法制备囊液总蛋白提取物,观察不同的蛋白样品处理方法、IPG胶条pH范围和电泳上样量对双向电泳图谱的影响。结果经ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit处理的提取物上样量为400μg,在pH7-10范围的胶条进行双向电泳分离,可获取蛋白斑点较多、重复性较好的二维电泳图谱。结论建立的细粒棘球蚴囊液双向电泳技术及图谱,可为细粒棘球蚴虫蛋白质组学的研究提供理论依据。

关键词：细粒棘球蚴囊液蛋白质组学双向电泳

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原头蚴及囊液促进小鼠脾细胞产生IL-2

免疫学杂志 2016年第3期32卷 215-219页

作者：蒋红群方海瑞陈聪哲董丹陈雪玲石河子大学医学院免疫学教研室 832000

目的观察细粒棘球绦虫幼虫原头蚴及囊液对体外培养小鼠脾细胞产生IL-22的影响。方法取Balb/c小鼠脾细胞,分别加入不同浓度原头蚴或囊液共培养48 h,检测上清液IL-22表达量及细胞IL-22 m RNA的相对表达量。同浓度原头蚴或囊液分别在0、12... 详细信息

目的观察细粒棘球绦虫幼虫原头蚴及囊液对体外培养小鼠脾细胞产生IL-22的影响。方法取Balb/c小鼠脾细胞,分别加入不同浓度原头蚴或囊液共培养48 h,检测上清液IL-22表达量及细胞IL-22 m RNA的相对表达量。同浓度原头蚴或囊液分别在0、12、24、36和48 h收集细胞,流式细胞术检测CD4+IL-22+T细胞比例变化。RPMI 1640培养基与脾细胞共培养设为对照组。结果与对照组相比,ELISA和q RT-PCR检测显示在原头蚴为1 000/ml和囊液蛋白质量浓度为2.05 mg/ml时脾细胞产生IL-22增加;流式细胞术检测原头蚴组及囊液组CD4+IL-22+T细胞比例逐渐增加。结论原头蚴及囊液均可促进小鼠脾细胞产生IL-22增加,提示IL-22可能参与宿主防御细粒棘球蚴感染。

关键词：原头蚴囊液脾细胞 IL-22

细粒棘球蚴囊液对肝细胞表面TLR4表达的调节

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中华微生物学和免疫学杂志 2009年第9期29卷 858-860页

作者：张亚楼黄河方全华刘涛任智慧李亮温浩新疆医科大学第一附属医院医学研究中心乌鲁木齐830054

目的通过研究细粒棘球绦虫囊液对人肝细胞中Toll样受体（TLR）4表达的影响，探讨TLR在启动囊液抗细粒棘球绦虫信号转导通路中的作用。方法用定量PCR检测肝细胞7404囊液处理前后TLR4和TGF-β1的表达变化。结果肝细胞7404经囊液处理后随... 详细信息

目的通过研究细粒棘球绦虫囊液对人肝细胞中Toll样受体（TLR）4表达的影响，探讨TLR在启动囊液抗细粒棘球绦虫信号转导通路中的作用。方法用定量PCR检测肝细胞7404囊液处理前后TLR4和TGF-β1的表达变化。结果肝细胞7404经囊液处理后随剂量增加TLR4表达减弱，TGF-β1随剂量增加表达增强，TLR2表达在各组均很低。结论囊液可以上调TLR4的表达，提示囊液诱导的抗细粒棘球绦虫的信号转导途径可能由TLR4引起。高剂量囊液有助于TGF—β1所致的免疫逃避作用。

关键词：细粒棘球绦虫囊液 Toll样受体天然免疫