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沙门氏菌噬菌体LPSEYT的基因组学分析及其裂解酶杀菌活性研究

沙门氏菌噬菌体LPSEYT的基因组学分析及其裂解酶杀菌活性研究

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作者：晏婷华中农业大学

学位级别：硕士

食源性病原菌所引起的食品安全问题是最重要的公共卫生问题之一。近年来,食源性病原菌的耐药问题日趋严重,使得食品安全面临更大的挑战。为应对这一严峻的形势,急需对新型食品安全防控技术进行研发。噬菌体作为细菌的特异性病毒,与细菌... 详细信息

食源性病原菌所引起的食品安全问题是最重要的公共卫生问题之一。近年来,食源性病原菌的耐药问题日趋严重,使得食品安全面临更大的挑战。为应对这一严峻的形势,急需对新型食品安全防控技术进行研发。噬菌体作为细菌的特异性病毒,与细菌进行了 30亿年甚至更久远的博弈,使噬菌体极具多样性并进化出高效杀菌的特殊蛋白——如噬菌体裂解酶。因此,可通过筛选高效杀菌的噬菌体或筛选基于噬菌体的高效杀菌产物,以此为基础进行新型食品安全防控技术的研发,为耐药性食源性病原菌的防控提供新思路。本课题组前期筛选到一株裂解谱广、杀菌活性强的沙门氏菌(Salmonella)噬菌体LPSEYT,为进一步促进该噬菌体在食品安全中的应用,本研究对该噬菌体的基因组进行分析。噬菌体LPSEYT基因组为53,387 bp的dsDNA,预测出73个ORFs。根据功能基因组学分析,该噬菌体未发现编码毒力因子、耐药相关和溶源性相关的基因。基于全基因组和系统发育分析,确定了噬菌体LPSEYT属于一新噬菌体属LPSEYTvirus。在功能基因组学分析的基础上对推定的噬菌体裂解酶(LT-Lysin40)进行结构分析,发现其具有N端跨膜结构域和信号肽序列,推测该裂解酶为带有信号锚定释放域的裂解酶(Signal-arrest-release endolysin,SAR-endolysin)。根据SAR-endolysin的特性,初步推测其具有可不依赖于孔蛋白(或针孔蛋白)从细胞内裂解细菌的活性。为研究噬菌体LPSEYT裂解酶LT-Lysin40的“自内裂解”活性,本研究构建了 pBAD24-LT-Lysin40重组质粒并转化到4种常见的大肠杆菌(Escherichia coli)工程菌株(trans5α、BL21(DE3)、BL21(AI)和 BL21(DE3)pLysS),实验证明LT-Lysin40在阿拉伯糖诱导表达8 h、8 h、3.5 h、3.5 h后菌液OD600值降至最低,最大可使菌液分别下降0.38、0.46、0.49和0.49个OD。同时将pBAD24-LT-Lysin40转化到致病性大肠杆菌(ATCC 700728)和沙门氏菌(ATCC 13311)中,均能观察到自内裂解的效果,分别在诱导4h和1.5 h后其菌液OD600值降至最低。LT-Lysin40的“自内裂解”活性鉴定证明了基于该裂解酶构建“自内裂解”技术的可行性。对LT-Lysin40裂解酶结构进行进一步分析,发现其C端具有阳离子(+6)α螺旋区域,推测其具有杀菌活性。研究发现LT-Lysin40肽段EYT,即噬菌体源抗菌肽(噬菌肽),对沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)均具有杀菌活性,其中对副溶血弧菌和鲍曼不动杆菌的杀菌效果最佳,100 μg/mL噬菌肽可在1 h内于37℃条件下杀灭104 CFU/mL的副溶血弧菌和105 CFU/mL的鲍曼不动杆菌,相同条件下浓度低至25 μg/mL仍能完全杀灭104CFU/mL的细菌。此外,研究发现替换EYT的部分序列形成的衍生肽EYTdele-3-SQ-8C具有相似的杀菌效果。本研究对噬菌体LPSEYT的基因组进行解析,未发现溶原性相关基因、以及毒力和耐药基因,表明其具有安全应用的潜力并建立了新的噬菌体属,挖掘了噬菌体裂解酶LT-Lysin40的结构和功能特征,从而构建了可用于肠杆菌科细菌裂解的“自内裂解”技术。同时进一步挖掘出LT-Lysin40裂解酶肽段,即噬菌肽,作为广谱抗菌剂的开发潜力。本研究将为其他噬菌体的应用开发提供参考。

关键词：噬菌体噬菌体裂解酶自内裂解噬菌肽

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