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微生物学报 2020年第4期60卷 759-768页

作者：包红朵朱树娇张辉周艳张旭晖庞茂达孙利厂李维王冉江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地农业部农产品质量安全风险评估实验室(南京)江苏南京210014 南京林业大学林学院江苏南京210037 中粮饲料有限公司北京100020

【目的】筛选鉴定沙门菌噬菌体侵染裂解过程中的抗性菌株,研究抗性菌株的生物学特性及致病力的差异,为解决噬菌体治疗应用中的抗性菌问题提供理论依据。【方法】本研究通过次级感染法和双层平板法筛选沙门菌噬菌体抗性菌,通过生物学特... 详细信息

【目的】筛选鉴定沙门菌噬菌体侵染裂解过程中的抗性菌株,研究抗性菌株的生物学特性及致病力的差异,为解决噬菌体治疗应用中的抗性菌问题提供理论依据。【方法】本研究通过次级感染法和双层平板法筛选沙门菌噬菌体抗性菌,通过生物学特性和毒力基因检测比较宿主菌ATCC 13076及其噬菌体抗性菌株R3之间的差异,并通过小鼠攻毒实验和细胞粘附实验比较致病力强弱。【结果】噬菌体抗性菌株R3的生长速度较宿主菌略慢;生化及毒力基因检测均表明抗性菌株与宿主菌无差异;与宿主菌相比,抗性菌R3的LD50增加了74.8%(P>0.05);对MODE-K细胞粘附能力稍弱,但是差异不显著。【结论】该研究表明,与噬菌体宿主菌相比,噬菌体抗性菌株的生物学特性和毒力基因并没有改变,对小鼠致病力减弱,但是对MODE-K细胞粘附能力差异不显著。

关键词：沙门菌噬菌体抗性菌毒力基因生物学特性致病力

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高毒力肺炎克雷伯菌噬菌体的分离鉴定及噬菌体抗性菌毒力降低的机制研究

高毒力肺炎克雷伯菌噬菌体的分离鉴定及噬菌体抗性菌毒力降低的机...

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作者：宋灵洁成都医学院

学位级别：硕士

噬菌体（Bacteriophage,phage）是一类在自然界中常见的细菌病毒,具有繁杂的种类和庞大的数量,目前已经广泛应用于细菌感染的治疗。噬菌体具有物种特异性,能在裂解病原菌的同时不会导致菌群失调,被认为是在“后抗生素时代”应对多重耐... 详细信息

噬菌体（Bacteriophage,phage）是一类在自然界中常见的细菌病毒,具有繁杂的种类和庞大的数量,目前已经广泛应用于细菌感染的治疗。噬菌体具有物种特异性,能在裂解病原菌的同时不会导致菌群失调,被认为是在“后抗生素时代”应对多重耐药细菌和“超级细菌”的有力武器,噬菌体治疗价值再一次引发了极大的关注,人们开始对噬菌体治疗价值进行重新审视和评估。研究背景与目的:高毒力肺炎克雷伯菌能导致健康人的感染,引起严重的肺炎、化脓性肝脓肿和脓毒血症等感染性疾病,对人类的健康造成了极大的危害。目前已有分离出抗生素耐药的高毒力菌株的报道,为临床治疗带来挑战。为解决上述问题,本课题以临床分离的高毒力肺炎克雷伯菌为宿主,为噬菌体进行高毒力肺炎克雷伯菌的临床治疗提供一些参考。同时对噬菌体治疗过程中产生的噬菌体抗性问题进行深入的探索。材料与方法:以临床分离的高毒力肺炎克雷伯菌为宿主,从污水中分离噬菌体。采用双层平板法观察噬菌斑,负染法电镜观察噬菌体的形态,并分析不同温度和p H下的稳定性,测定吸附效率和一步生长曲线,点滴法确定宿主范围,提取噬菌体的核酸进行测序及分析,采用大蜡螟感染模型检测噬菌体的治疗效果。从噬菌体和宿主菌共生的平板上选取噬菌体抗性突变株,采用每小时测定OD值的方法对突变株进行生长情况进行测定,采用透射电镜观察突变株是否产生荚膜进行研究,通过巨噬细胞吸附实验和大蜡螟毒力实验对突变株的毒力水平进行判定。将突变株进行重测序,分析其与野生型的差异基因,并通过野生型基因的回补进行验证。结果:1.成功分离得到两株裂解型噬菌体hv Kp P1和hv Kp P2,噬菌体能够在双层菌平板上形成不同形态的噬菌斑,电镜下观察到两株噬菌体均为短尾噬菌体。2.两株噬菌体能在较宽泛的理化条件下保持活性,特异性裂解部分肺炎克雷伯菌。两者的吸附时间差异较小,一步生长曲线显示,hv Kp P1的潜伏期更短、裂解量更高。3.两株噬菌体的基因组测序结果表明,hv Kp P1为双链线性DNA,基因组全长44066 bp,GC含量为54%,预测的ORFs数量为55个;hv Kp P2也为双链线性DNA,基因组全长44314 bp,GC含量为53.9%,预测的ORFs数量为58个。4.在大蜡螟感染模型治疗实验中,两株噬菌体在大蜡螟幼虫感染模型中具有较好的治疗效果。5.在噬菌体hv Kp P1和hv Kp P2的选择压力下,高毒力肺炎克雷伯菌hv Kp LS7能产生噬菌体抗性菌,频率为5±1×10-5。6.随机选取的四株噬菌体抗性突变株,在平板上形成小而粗糙的菌落,这些菌在低速离心下能够很好地聚集,透射电镜图显示突变株的荚膜缺失;相比于野生型菌,噬菌体抗性菌更容易被巨噬细胞吞噬,并且在大蜡螟感染模型中表现出更低的毒力。7.通过测序比对基因组分析,发现噬菌体抗性菌中wzc和wca J存在突变;并随机选取了41株突变菌进行测序比对,发现有17个突变株存在wzc基因突变,有13个突变株存在wca J基因突变。通过野生型的wzc和wca J基因的回补实验,对应的突变株恢复对噬菌体的敏感性和毒力。结论:1.本研究分离的两株针对于K57血清荚膜型的噬菌体hv Kp P1和hv Kp P2,两者都能在较宽泛的理化条件下保持稳定性。两株噬菌体的吸附时间短且爆发量大,与已报到的针对于高毒力肺炎克雷伯菌噬菌体具有较大差异。大蜡螟感染模型的噬菌体治疗效果较好,证明两株新发现的噬菌体有望应用于临床治疗。2.本研究中随机选取的噬菌体抗性菌存在wzc或wca J基因的突变,导致细菌生成荚膜受阻,由于荚膜是噬菌体hv Kp P1和hv Kp P2的吸附受体,因此这些菌无法被两噬菌体吸附,又因为荚膜是肺炎克雷伯菌的毒力因子,因此突变株在对噬菌体产生抗性的同时毒力也随之降低。

关键词：肺炎克雷伯菌噬菌体噬菌体治疗噬菌体抗性菌毒力

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