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人源抗伊维菌素单链抗体的筛选、表达及结构功能分析

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人源抗伊维菌素单链抗体的筛选、表达及结构功能分析

作者：温爽扬州大学

学位级别：硕士

伊维菌素是由阿维链霉菌发酵合成的一种大环内酯类多组分抗生素,被有效用作农药、兽药及人抗寄生虫药物。它能打开谷氨酸控制的Cl-通道,导致膜超极化,使肌肉细胞丧失收缩能力,从而导致虫体死亡。长期以来,伊维菌素被认为是安全的抗寄生... 详细信息

伊维菌素是由阿维链霉菌发酵合成的一种大环内酯类多组分抗生素,被有效用作农药、兽药及人抗寄生虫药物。它能打开谷氨酸控制的Cl-通道,导致膜超极化,使肌肉细胞丧失收缩能力,从而导致虫体死亡。长期以来,伊维菌素被认为是安全的抗寄生虫药物,但是近年的研究结果表明,它的残留能降低牧草产量,影响水生群落,对环境平衡有重大威胁。伊维菌素的广泛应用和潜在危害的并存,使得建立一种简单高效的伊维菌素残留检测方法很有必要。目前建立的伊维菌素检测方法主要有中空纤维支撑液膜萃取法和液相色谱质谱-质谱法。这些方法需要昂贵的仪器及繁琐的前处理步骤,相比之下,免疫检测法较为快速、经济。现已有关于伊维菌素单克隆和多克隆抗体的报道,还未见其单链抗体的报道。本研究在参照国内外相关研究的基础上,以期从人源噬菌体抗体库中筛选出抗伊维菌素的单链抗体,并对其进行可溶性表达、蛋白结构功能分析,为环境及农产品中伊维菌素的安全监控提供材料,为研究抗原抗体反应提供理论基础。噬菌体展示技术是一种制备高亲和力抗体的有力工具,抗体库技术则为筛选高亲和力抗体提供了良好的平台。展示抗体的基因型与表现型的有效统一,使其不仅在农药残留检测及抗体制备等方面具有广泛应用前景,还能有效地应用于基因工程改造。研究目的和意义:应用噬菌体抗体库技术,筛选人源抗伊维菌素单链抗体,以期应用于伊维菌素的安全监控。对筛选出的抗体进行可溶性表达、纯化后鉴定其免疫活性。对抗体的结构功能进行分析,为研究抗原抗体结合反应提供理论基础。研究方法:以伊维菌素-牛血清白蛋白为包被抗原,应用噬菌体抗体库技术,从库容约为108的人源噬菌体抗体库中筛选出抗伊维菌素单链抗体。采用固相消减筛选法,共进行4轮“吸附-洗脱-富集”。对结合活性较强的阳性克隆,制备噬菌体上清,转化E.coli HB2151,以IPTG进行诱导,表达的可溶性抗体过镍亲和层析柱纯化,建立竞争抑制ELISA检测方法,进行灵敏度测定。应用计算机软件及生物信息学站点对抗体的结构功能进行分析。研究结果:经过四轮富集筛选,从人源抗体库中筛选出7株不同的阳性克隆,hsIVM8展示了最高的亲和力。IPTG成功诱导表达hsIVM8,SDS-PAGE显示其分子量约为28 kD,伊维菌素对纯化抗体的抑制中浓度IC50为4.11μg/mL,线性检测范围为0.1-5μg/mL。研究成果:从人源噬菌体抗体库中成功筛选到抗伊维菌素的单链抗体,有望应用于环境和农产品中伊维菌素的安全监控。对抗体蛋白进行的结构功能分析为研究抗体性质及与抗原反应机理提供理论基础。

关键词：噬菌体抗体库技术伊维菌素筛选表达结构功能分析

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肝癌单链抗体研究与导向治疗进展

中华实验外科杂志 2009年第8期26卷 959-960页

作者：窦科峰金成第四军医大学西京医院肝胆胰脾外科西安710032

近年来，随着免疫学和分子生物学的发展，肝癌单链抗体（ScFv）研究取得长足进步。ScFv具有分子小、穿透力强、廓清速度快、异源性低、易于大量生产等优点，能够中和病毒和毒素，进行细胞内免疫和作为导向载体，在肝癌诊断和治疗领域中... 详细信息

近年来，随着免疫学和分子生物学的发展，肝癌单链抗体（ScFv）研究取得长足进步。ScFv具有分子小、穿透力强、廓清速度快、异源性低、易于大量生产等优点，能够中和病毒和毒素，进行细胞内免疫和作为导向载体，在肝癌诊断和治疗领域中显示出了巨大的潜力。本文重点介绍肝癌ScFv研究的热点问题：噬菌体抗体库技术、特异性抗体筛选鉴定、表达系统和导向治疗的进展。

关键词：肝癌诊断导向治疗单链抗体噬菌体抗体库技术分子生物学 ScFv 细胞内免疫导向载体

泪液乳铁蛋白夹心法酶联免疫吸附试验的建立及初步临床应用

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中华眼科杂志 2007年第5期43卷 451-453页

作者：虞东芳刘祖国胡皎月蒋爱华郝尚臣许传超邹文进李民友中山大学中山眼科中心中山大学眼科学国家重点实验室中山大学眼表疾病研究中心广州510060 中山大学基础医学院生化教研室

泪液乳铁蛋白（lactoferrin，LF）是泪液中最主要的抗菌蛋白质，对眼表组织起积极防护作用，其含量在很大程度上能反映泪腺的外分泌功能。干眼是与泪膜密切相关的眼表疾病，病因复杂、临床表现多样，诊断存在较大困难。多项研究表明，泪... 详细信息

泪液乳铁蛋白（lactoferrin，LF）是泪液中最主要的抗菌蛋白质，对眼表组织起积极防护作用，其含量在很大程度上能反映泪腺的外分泌功能。干眼是与泪膜密切相关的眼表疾病，病因复杂、临床表现多样，诊断存在较大困难。多项研究表明，泪液LF含量检测可能是诊断干眼最敏感特异的指标。本研究应用噬菌体抗体库技术和动物免疫制备了抗人LF单链抗体和兔抗人LF多克隆抗体，建立LF的双抗夹心酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法，以检测泪液LF含量，评价该指标对于干眼的诊断价值。

关键词：酶联免疫吸附试验乳铁蛋白初步临床应用泪液夹心法噬菌体抗体库技术诊断价值眼表疾病

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抗SARS抗体独特型单链抗体的筛选及鉴定

免疫学杂志 2006年第2期22卷 224-226页

作者：何峰容王晓娟周小欧李曼君朱慧芬吴万敏沈关心湖北省新华医院检验科武汉430015 内蒙古医学院第一附属院普通外科呼和浩特010050 华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系武汉430030

目的从人源噬菌体抗体库中筛选抗SARS独特型抗体为SARS的诊断及疫苗的研究奠定基础。方法以混合SARS病人恢复期血清免疫球蛋白(Ig)作为筛选分子,从噬菌体抗体库中筛选出能与病人血清IgG(IgM)结合的抗体,并通过与混合正常人血清Ig作负性... 详细信息

目的从人源噬菌体抗体库中筛选抗SARS独特型抗体为SARS的诊断及疫苗的研究奠定基础。方法以混合SARS病人恢复期血清免疫球蛋白(Ig)作为筛选分子,从噬菌体抗体库中筛选出能与病人血清IgG(IgM)结合的抗体,并通过与混合正常人血清Ig作负性筛选,从而获得抗SARS病毒的独特型抗体(AId)。通过4轮“吸附-洗涤-扩增”,从最后一轮所得单克隆菌株中分别通过ELISA筛选出能和SARS病人恢复期血清Ig结合的菌株,提取质粒DNA,并对PCR扩增产物进行DNA序列测定,最后用所筛选的克隆通过与不同人群血清反应,证实其特异性。结果随机挑选经第4轮筛选后的200个单克隆菌落,其中有10个与SARS病人恢复期血清Ig结合的OD值明显高于其与正常人Ig结合的OD值;以上10个克隆经PCR扩增,其中有6个克隆于1 000 bp处有电泳条带;其DNA序列经与BLAST数据库和IMGT/QUEST软件比对有5个均与人的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)高度同源,且与其同源性最高的人Ig的VH属VHI亚群,VL属k链,属VKⅡ亚群;最后确认有3个克隆其噬菌体抗体和SARS病人血清Ig结合的OD值均明显高于与正常人血清Ig结合的OD值。结论利用抗体库技术可不经免疫制备特异性抗SARS抗体独特型抗体,为SARS诊断及疫苗的研制奠定基础。

关键词： SARS 噬菌体抗体库技术独特型抗体(AId) 单链抗体(ScFv)

用噬菌体蛋白Ⅸ展示抗HBsAg分子Fab段

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中华微生物学和免疫学杂志 2004年第1期24卷 52-56页

作者：张达矜王琰化冰刘晓琳海军总医院北京100037

目的　用丝状噬菌体外壳蛋白Ⅸ (pⅨ )展示抗体Fab段 ,并与外壳蛋白Ⅲ (pⅢ )展示效果进行比较。方法　采用PCR方法钓取噬菌体蛋白Ⅸ基因 ,构建pⅨ展示抗乙肝表面抗原Fab的表达载体 ,制备噬菌体抗体 ,鉴定其抗原结合活性和Fab呈现水平 ... 详细信息

目的　用丝状噬菌体外壳蛋白Ⅸ (pⅨ )展示抗体Fab段 ,并与外壳蛋白Ⅲ (pⅢ )展示效果进行比较。方法　采用PCR方法钓取噬菌体蛋白Ⅸ基因 ,构建pⅨ展示抗乙肝表面抗原Fab的表达载体 ,制备噬菌体抗体 ,鉴定其抗原结合活性和Fab呈现水平 ,观察了噬菌体洗脱回收效率 ,并与pⅢ展示进行比较。结果　噬菌体pⅨ可以展示有功能活性的抗体Fab段 ,但对Fab的展示率低于pⅢ ,展示率的高低可能与pⅨ展示的外源蛋白分子量大小有关。“结合洗脱回收”实验显示 ,酸洗脱法回收的Fab pⅢ噬菌体的感染活性大为下降 ,而对Fab pⅨ噬菌体无影响。结论　pⅨ成功展示Fab段。

关键词：噬菌体蛋白抗乙肝表面抗原基因表达载体噬菌体抗体噬菌体抗体库技术

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基因工程抗体的研究进展

中国兽医科技 2003年第6期33卷 36-41页

作者：李有全刘光远白启邱昌庆中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃兰州730046

基因工程抗体(gene engineering antibody, GEAb)是通过PCR技术获得抗体基因或抗体片段基因，与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体，被广泛应用于疾病的临床诊断、预防和治疗、基础理论研究等诸多领域，并取得令人鼓舞的结果... 详细信息

基因工程抗体(gene engineering antibody, GEAb)是通过PCR技术获得抗体基因或抗体片段基因，与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体，被广泛应用于疾病的临床诊断、预防和治疗、基础理论研究等诸多领域，并取得令人鼓舞的结果。鉴于鼠源性单抗会引起人抗鼠抗体反应，影响疗效而不能重复使用，同时用杂交瘤技术生产单抗成本较高而难以普及，于是各国学者即而转向GEAb的研究。1984年，国外首次报道在骨髓瘤细胞中成功表达人-鼠嵌合抗体，开创了GEAb技术的先河~[1]。1988年以来，伴随着用大肠埃希氏菌成功表达具生物活性抗体片段，用PCR技术快速克隆免疫球蛋白可变区基因以及利用噬菌体表达抗体建立有效筛选系统这三方面技术上的突破，围绕如何降低鼠源单抗的免疫原性问题。GEAb才得以迅速发展，并从而成为现代免疫学研究的热点之一。

关键词：基因工程抗体 PCR技术免疫学分类噬菌体抗体库技术转基因小鼠人源化小鼠宿主表达系统临床应用

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全人源单克隆抗体现状及发展趋势(续)

国际生物制品学杂志 2011年第5期34卷 225-229页

作者：孟胜利武汉生物制品研究所狂犬病疫苗室

4 技术平台全人源单抗是抗体工程技术发展的重要趋势。目前全人源单抗的研发技术主要有:B细胞永生化技术、噬菌体抗体库技术、转基因小鼠技术以及人源杂交瘤技术等。其中以噬菌体展示技术和转基因小鼠技术实际应用最广泛、最成功。

关键词：人源单克隆抗体噬菌体抗体库技术转基因小鼠人源单抗噬菌体展示技术杂交瘤技术永生化技术研发技术实际应用抗体工程技术平台技术发展细胞

中华实验和临床病毒学杂志2000年第14卷主题词索引

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中华实验和临床病毒学杂志 2000年第4期 103-107+110页

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噬菌体基因工程抗体的制备与修饰

高校保健医学研究与实践 2005年第3期2卷 50-54页

作者：刘志林广东外语外贸大学门诊部广州510420

20世纪90年代兴起的噬菌体抗体库技术代表了当今基因工程抗体制备的前沿技术,PCR快速扩增可变区基因、噬菌体表面呈现技术(phage surface display)和大肠杆菌分泌有结合功能的免疫球蛋白分子片段的成功是该技术得以发展的三大基石[1-3].... 详细信息

20世纪90年代兴起的噬菌体抗体库技术代表了当今基因工程抗体制备的前沿技术,PCR快速扩增可变区基因、噬菌体表面呈现技术(phage surface display)和大肠杆菌分泌有结合功能的免疫球蛋白分子片段的成功是该技术得以发展的三大基石[1-3].1989年,Ward首次克隆了VH基因库[1];同年,Huse[3]首次构建了Fab抗体库,并用标记抗原筛选特异性抗体获得成功,此举开创了用噬菌体抗体库筛选单克隆抗体的先河.

关键词：基因工程抗体噬菌体表面呈现技术噬菌体抗体库技术 20世纪90年代免疫球蛋白分子修饰 Fab抗体库可变区基因 1989年特异性抗体单克隆抗体前沿技术抗体制备结合功能大肠杆菌标记抗原 PCR 基因库库筛选