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铜绿假单胞菌噬菌体K4性质及应用研究

铜绿假单胞菌噬菌体K4性质及应用研究

作者：庞文静天津科技大学

学位级别：硕士

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是自然界常见的机会致病菌,能够引起人类一系列感染,同时也是导致食品腐败的主要病原菌。近几年,由于抗菌素的广泛使用,导致其耐药性菌株频繁出现,其耐药性菌株的出现给食品安全和环境卫生等方面... 详细信息

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是自然界常见的机会致病菌,能够引起人类一系列感染,同时也是导致食品腐败的主要病原菌。近几年,由于抗菌素的广泛使用,导致其耐药性菌株频繁出现,其耐药性菌株的出现给食品安全和环境卫生等方面带来了严重的威胁。噬菌体作为抑菌剂与抗生素均可达到抑菌效果,噬菌体作为抑菌剂可特异性抑制细菌增长的同时其自身也在不断增长,相比于抗生素其有更好的应用前景。因此,亟需开发新型杀菌剂,本研究对本实验室分离的铜绿假单胞菌噬菌体K4进行了基本生物学特性、基因组学、分类学、抑菌活性以及应用的分析研究。一步生长曲线结果表明,噬菌体K4的潜伏期约为15 min,释放量约为85pfu/infection center;抑菌曲线结果表明,在不同感染复数(MOI)下,噬菌体K4对宿主菌均有明显的抑制效果;稳定性实验结果表明,噬菌体K4具有较好的热稳定性、氯仿稳定性及酸碱稳定性;宿主范围分析结果表明,噬菌体K4不能裂解wbp R、wbp T、wbp V、wzy、ssg、BN889＿05221基因缺失的PAK菌株,这些基因均与LPS的合成相关,即为生物合成O-specific antigen(OSA)的相关基因,因此推测铜绿假单胞菌噬菌体K4的受体为OSA。基因组分析显示,噬菌体K4为线性双链DNA分子,基因组有74 bp的正向末端重复序列。噬菌体K4基因组的长度为50358 bp,有77个蛋白编码基因,编码46个假定蛋白、31个具有假定功能的蛋白,其中包括参与复制、转录、DNA修复、磷酸代谢等功能蛋白和1个t RNA-Arg;我们选取了8株铜绿假单胞菌噬菌体进行比较基因组学分析,同时又选取了氨基酸水平上蛋白功能相同的噬菌体,对其主要衣壳蛋白和大亚基进行进化树分析。分析发现噬菌体K4与Paundecimvirus属的Pseudomonas virus PA11基因组序列的一致性达95.08%,因此K4可能是该属的新成员。应用实验表明,在噬菌体K4对牛奶中细菌的影响实验中,4°C条件下,噬菌体MOI为1和10时抑菌效率分别高达93.73%和99.02%,噬菌体分别增长了71和22倍;25°C条件下,噬菌体MOI为1和10时抑菌效率分别为79.29%和98.84%,噬菌体分别增长了149和142倍。在噬菌体K4对午餐肉中细菌的影响实验中,4°C条件下,噬菌体MOI为1和10时抑菌效率分别高达96.34%和88.28%,噬菌体分别增长了3倍和6倍;25°C条件下,噬菌体MOI为1和10时抑菌效率分别为94.89%和99.15%,噬菌体分别增长了33和78倍。实验结果表明,噬菌体K4能够显著抑制牛奶和午餐肉等样品中铜绿假单胞菌的生长,同时噬菌体的数量也有显著地增加,适合作为抑菌剂应用于食品安全等领域。本研究结果显示,噬菌体K4的生长速度快,具其有较强的杀菌活性,且该基因组不携带整合酶、抗性以及毒力因子等编码基因。因此,噬菌体K4可以用于控制食品中铜绿假单胞菌的污染。

关键词：铜绿假单胞菌噬菌体K4 噬菌体受体抑菌活性基因组注释噬菌体应用

肠侵袭性大肠埃希菌噬菌体DK-13的分离鉴定和初步应用探究

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肠侵袭性大肠埃希菌噬菌体DK-13的分离鉴定和初步应用探究

作者：刘家齐吉林大学

学位级别：硕士

肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)是致病性大肠杆菌之一,主要引起较大儿童和成年人的严重腹泻,EIEC不产生肠毒素,主要通过入侵人类结肠上皮细胞,在细胞内增殖并延伸到相邻的上皮细胞,与志贺菌有相似的致病机制。EIEC的感染多发生于缺乏或无法... 详细信息

肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)是致病性大肠杆菌之一,主要引起较大儿童和成年人的严重腹泻,EIEC不产生肠毒素,主要通过入侵人类结肠上皮细胞,在细胞内增殖并延伸到相邻的上皮细胞,与志贺菌有相似的致病机制。EIEC的感染多发生于缺乏或无法获得安全饮用水、卫生服务或电力的地区,摄入受污染的食物或水也可能发生感染,世界各地都曾爆发过由EIEC引起的食源性疾病,其中绝大多数是发展中国家。现如今面对抗生素的滥用,多重耐药菌的不断增加,以及食品安全领域传统食品杀菌方法的局限性,噬菌体疗法被认为是解决细菌抗生素耐药性有关危机的可能解决方案之一,噬菌体生物防治日益被接受为一种自然和绿色的抗菌手段而重回人们的视野。本研究以EIEC为宿主菌,从吉林大学第一医院采集的污水中分离出了一株烈性噬菌体DK-13,噬菌体DK-13属于有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科、T4噬菌体亚科噬菌体。为典型的蝌蚪状外形,包含一个直径约为100nm的正二十面体的头部和一个可收缩的螺旋对称的尾部;噬菌体DK-13具有很强的宿主特异性;噬菌体DK-13的最佳感染复数为0.01;一步生长曲线表明,DK-13的潜伏期约为10min,裂解期约为70min,平均爆发量为164PFU/cell;DK-13在50℃和60℃以及pH5～10的条件下仍能保持其生物学活性。本文对噬菌体DK-13的全基因组进行测序,测序结果已上传至GenBank,序列号为MT611523。噬菌体DK-13为环状双链DNA,基因组全长172275bp,GC含量为40.18%,含有两个tRNA,在噬菌体DK-13的基因组并未发现有关的毒力基因和耐药基因。噬菌体DK-13全基因组中共有293个ORFs,根据其功能分为结构基因模块、包装基因模块、核苷酸代谢基因模块、复制/重组基因模块、转录/翻译基因模块和其他功能六个模块;进化分析显示,噬菌体DK-13与已报道的大肠埃希菌噬菌体vBcoMR20的进化关系最近。细菌形成的生物膜具有医疗危害,它增加了细菌对抗生素和宿主免疫系统的耐药性,并与持续感染有关。EIEC又会污染水、猪肉、牛奶、水果和蔬菜等食品传播食源性疾病。本文利用噬菌体DK-13,对其是否能有效裂解或抑制生物膜的形成进行探究,并对其在猪肉和牛奶中的杀菌效果方面进行初步应用,结果发现,噬菌体DK-13能有效裂解和抑制生物膜的形成,且可以有效降低猪肉和牛奶中的宿主菌数量。综上,噬菌体DK-13在医疗和食品安全方面存在很大潜力,未来可以考虑应用于噬菌体疗法和噬菌体制剂的开发。

关键词：肠侵袭性大肠埃希菌噬菌体生物学特性基因组分析噬菌体应用

蜡样芽胞杆菌噬菌体BC-T25的分离鉴定和初步应用探究

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蜡样芽胞杆菌噬菌体BC-T25的分离鉴定和初步应用探究

作者：铁丹丹吉林大学

学位级别：硕士

蜡样芽胞杆菌是一种食源性致病菌,能够引起腹泻呕吐综合征。该菌在自然界中广泛存在,常存在于土壤、灰尘和污水中。它污染的食物主要是富含淀粉的食物,如大米和面食,此外,还会污染蔬菜、乳制品、发酵食品和肉类,是我国引起食物中毒的主... 详细信息

蜡样芽胞杆菌是一种食源性致病菌,能够引起腹泻呕吐综合征。该菌在自然界中广泛存在,常存在于土壤、灰尘和污水中。它污染的食物主要是富含淀粉的食物,如大米和面食,此外,还会污染蔬菜、乳制品、发酵食品和肉类,是我国引起食物中毒的主要病原菌之一。尽管现代技术取得了进步,但食品工业仍面临着微生物污染的威胁。抗生素的过度使用,导致蜡样芽胞杆菌出现越来越多的耐药菌株。并且该菌可以产生抗逆性强的芽胞和高温灭菌不能破坏的肠毒素,传统的食品灭菌方法面对日益严重的食品安全问题逐渐体现出它们的局限性,努力开发新的方法来控制食品和食品加工环境中的蜡样芽胞杆菌的污染非常重要,所以噬菌体作为天然生物灭菌的方法逐渐进入人们的视线。本研究以蜡样芽胞杆菌为宿主菌,从吉林大学第一医院未经处理的废水中筛选出一株裂解性噬菌体,命名为BC-T25。通过透射电子显微镜观察,噬菌体BC-T25属于有尾噬菌体目长尾噬菌体科,是蜡样芽胞杆菌噬菌体中比较常见的一类噬菌体。噬菌体BC-T25的头部为正二十面体对称的头部,直径约为94.3nm。其生物学特性试验的结果显示:噬菌体BC-T25的潜伏期较短,裂解性强,稳定性高。潜伏期为20min,裂解期为40min,平均爆发量为930 PFU/cell,噬菌体BC-T25的最佳感染复数为1,噬菌体BC-T25的热稳定性较好,能在50℃和60℃的温度下存活一小时以上仍保持较高活力,而在70℃的环境30min后才基本失去活性。噬菌体BC-T25的酸碱稳定性也比较好,只有在pH≤3或≥11时才会失活。噬菌体BC-T25的基因可以被六种限制性核酸内切酶(HindⅢ、XbaⅠ、SacⅠ、KpnⅠ、EcoRⅤ、NdeⅠ)切开。本研究对噬菌体BC-T25进行了全基因组测序,测序结果以上传至GenBank,序列号为MN150686。噬菌体BC-T25基因组全长为157977bp,GC含量为40.03%,含有16个tRNA,目前未发现基因组中存在毒力基因和耐药基因。噬菌体BC-T25的基因组共含有236个开放阅读框(ORF),其中正向的有203个,反向的有33个。其中推定为已知功能的ORFs有42个,其余都为未知功能的假定蛋白。进化分析显示,噬菌体BC-T25与已报导的蜡样芽胞杆菌噬菌体的亲缘关系非常接近。本研究对噬菌体BC-T25在人工污染的发酵食品(清麴酱)上的杀菌效果进行了试验,结果显示:噬菌体BC-T25可以有效的抑制宿主菌蜡样芽胞杆菌的生长,对枯草芽胞杆菌的生长无影响。同时当环境中含有单一阳离子Ca2+、Mg2+或多种阳离子Ca、Mg、Na混合时噬菌体的杀菌作用会提高,只有单独Na对杀菌效果并不明显。综上,本研究对分离的蜡样芽胞杆菌噬菌体BC-T25进行了生物学特性探究和全基因组的初步分析,且在抑制发酵食品中蜡样芽胞杆菌污染的应用表现良好,可以为将来的食品安全问题的防治提供一些方向和基础数据。

关键词：蜡样芽胞杆菌噬菌体生物学特性基因组分析噬菌体应用

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噬菌体与细菌生物膜相互作用的研究进展

中国动物传染病学报 2022年

作者：万启旸包红朵张辉朱树娇王冉周艳江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地

细菌生物膜是由多个细菌组成的群落结构，发挥着抵御外界恶劣环境的作用。研究发现细菌生物膜是细菌产生耐药性的重要原因之一，给食品和医疗等行业带来巨大的经济损失。而噬菌体作为能够感染并裂解细菌的病毒，可以有效抑制并清除细菌... 详细信息

细菌生物膜是由多个细菌组成的群落结构，发挥着抵御外界恶劣环境的作用。研究发现细菌生物膜是细菌产生耐药性的重要原因之一，给食品和医疗等行业带来巨大的经济损失。而噬菌体作为能够感染并裂解细菌的病毒，可以有效抑制并清除细菌生物膜。近年来研究表明噬菌体还能够促进细菌生物膜的形成，因此噬菌体与细菌生物膜的相互作用仍需要深入研究。本文综述了目前关于噬菌体和细菌生物膜的相互作用研究所取得的重要进展，包括作用机制，影响因素，以及噬菌体防控细菌生物膜形成的潜力等，为应用噬菌体有效遏制细菌危害提供理论依据。

关键词：噬菌体细菌生物膜抗菌噬菌体应用

铜绿假单胞菌噬菌体phiH2受体相关基因的发现

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铜绿假单胞菌噬菌体phiH2受体相关基因的发现

作者：李玥莹天津科技大学

学位级别：硕士

铜绿假单胞菌是一种机会性病原体,同时也是重要的食源性致病菌。由于抗菌素的广泛使用,频繁出现耐药性的菌株给食品安全和公共健康等方面带来了严重的威胁。因此迫切寻找新的杀菌剂和杀菌方法。噬菌体可特异性结合并裂解细菌,具有广阔... 详细信息

铜绿假单胞菌是一种机会性病原体,同时也是重要的食源性致病菌。由于抗菌素的广泛使用,频繁出现耐药性的菌株给食品安全和公共健康等方面带来了严重的威胁。因此迫切寻找新的杀菌剂和杀菌方法。噬菌体可特异性结合并裂解细菌,具有广阔的应用前景。前期本实验室使用铜绿假单胞菌作为指示菌,从污水污泥混合样品中分离得到的烈性噬菌体phiH2,本研究构建铜绿假单胞菌PAK转座子突变株文库,筛选耐受噬菌体phiH2的转座子突变株,分析噬菌体phiH2的受体相关基因。另一方面,初步研究了噬菌体phiH2的应用。通过构建Mariner转座子突变株文库,以铜绿假单胞菌PAK为宿主菌,筛选得到117株耐受噬菌体phiH2抗性突变株。利用spotting实验分析,93株没有透明斑出现,对噬菌体完全耐受,24株出现模糊透明斑,对噬菌体部分耐受。突变株吸附率测定。研究发现,野生型PAK吸附率仅为34.88%,完全耐受突变株的吸附率在2.46%-36.28%,IRP突变株的吸附率在13.08%-42.30%,表明与野生型PAK相比,大多数突变株的吸附率有明显下降。Ⅳ菌毛与细菌的蹭动行为twitching motility相关。我们比较分析了菌株的蹭动区域面积,插入突变株的蹭动面积为野生型菌株PAK的1%。推测突变菌株的Ⅳ型菌毛相关基因插入失活,导致有功能的Ⅳ型菌毛数量下降,细菌运动受到抑制。我们采用了反向PCR方法,鉴定了4株完全耐受突变株以及13株IRP突变株基因组上转座子的插入位点,发现被阻断基因多与Ⅳ型菌毛合成与组装相关,包括fim U、pil Y1、pil Y2、pil E、pil B等与Ⅳ菌毛合成的相关基因。Ⅳ型菌毛主要蛋白是Pil A,没有在转座子突变株文库中发现相应突变株。为了进一步验证前面的结果,我们在PAK菌株中,分别敲除了pil A,pil B,pil Y2和pil E基因并进行了互补回复。通过分析构建的重组菌株,确认了噬菌体phiH2以Ⅳ型菌毛作为吸附受体。另外,我们分析了突变株的绿脓素合成水平。突变株培养16 h后,突变株绿脓素含量与野生型PAK相比,增长了147.71%-654.45%;培养24 h后,突变株绿脓素含量与野生型PAK相比,增长了137.12%-454.36%。噬菌体phiH2应用实验。在高温灭菌的牛奶中,添加PAK以及噬菌体phiH2,控制MOI为1,噬菌体phiH2在4℃和25℃条件下,杀菌效率分别可以达到99.40%和92.07%,可以有效抑制铜绿假单胞菌PAK的生长,为噬菌体phiH2在食品防腐等方面的应用提供了实验依据。

关键词：铜绿假单胞菌噬菌体噬菌体受体吸附率 Twitching 绿脓素噬菌体应用