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从噬菌体库中筛选抗SARS病毒S蛋白的Fab中和活性抗体研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2005年第8期25卷 634-637页

作者：康晓平杨保安赵慧祝庆余军事医学科学院微生物流行病研究所

目的从SARS病毒噬菌体抗体库中筛选出具有中和活性的抗S蛋白Fab片段抗体。方法ELISA方法对抗体库进行富集筛选及人源抗体克隆结合活性的测定,竞争ELISA初步筛选有中和活性的抗体,中和试验进一步确定中和活性,进而对其序列进行测定和分... 详细信息

目的从SARS病毒噬菌体抗体库中筛选出具有中和活性的抗S蛋白Fab片段抗体。方法ELISA方法对抗体库进行富集筛选及人源抗体克隆结合活性的测定,竞争ELISA初步筛选有中和活性的抗体,中和试验进一步确定中和活性,进而对其序列进行测定和分析。结果特异性富集了抗S蛋白噬菌体抗体,竞争ELISA筛选出两株抗体可部分阻断中和抗体2C5与S蛋白的结合,中和试验确定其具有一定中和活性,编号为M1A和P8A,测序结果表明它们为两株不同的抗体克隆。结论筛选获得了两株抗体可部分中和SARS病毒活性,它们的获得为探索SARS病毒感染的被动免疫治疗打下了一定基础。

关键词：噬菌体抗体库人源抗体中和活性抗SARS病毒初步筛选片段抗体 S蛋白 Fab 噬菌体库竞争ELISA

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利用噬菌体库筛选IL-6拮抗剂及功能研究

中华微生物学和免疫学杂志 2003年第8期23卷 588-590页

作者：陶永涛黎燕沈倍奋冯建男胡美茹施明北京航天医学与工程研究所北京100094 军事医学科学院

目的　以人sIL 6R为靶分子 ,利用噬菌体随机 15肽库筛选其亲和短肽 ,结合计算机模拟分析 ,获得具有抑制IL 6 IL 6R结合作用的短肽序列 ,作为IL 6拮抗剂。方法　通过亲和筛选 ,获得一组sIL 6R特异亲和序列。测定序列 ,结合计算机模拟 ,... 详细信息

目的　以人sIL 6R为靶分子 ,利用噬菌体随机 15肽库筛选其亲和短肽 ,结合计算机模拟分析 ,获得具有抑制IL 6 IL 6R结合作用的短肽序列 ,作为IL 6拮抗剂。方法　通过亲和筛选 ,获得一组sIL 6R特异亲和序列。测定序列 ,结合计算机模拟 ,选取具有潜在拮抗功能的 2条肽 (命名为pT1、pT2 )。合成短肽 ,进行ELISA竞争抑制实验和细胞增殖抑制实验。结果　pT1、pT2均可抑制IL 6 sIL 6R的结合。pT1、pT2可抑制XG 7细胞的增殖 ,并且这种抑制作用随着合成肽浓度的增高而增强 ,pT1、pT2不影响 7TD1细胞的增殖。结论　利用亲和筛选并结合计算机模拟从随机 15肽库中获得可抑制IL 6 sIL 6R结合的短肽 ,并可抑制IL 6依赖细胞XG 7的增殖。

关键词：白细胞介素-6 拮抗剂噬菌体库富集效果产出/投入比序列分析

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噬菌体抗体库筛选技术研究进展

细胞与分子免疫学杂志 2005年第B3期21卷 58-59页

作者：薛国柱窦科峰第四军医大学西京医院肝胆外科陕西西安710032

噬菌体抗体是指在其表面表达有Fab抗体或单链抗体(scFv)的噬菌体.用基因克隆技术将B细胞全套可变区基因克隆出来, 组装到表达载体内并表达到噬菌体表面形成噬菌体抗体的群体, 即为噬菌体抗体库[1].经特定抗原或细胞筛选后, 便可获得特... 详细信息

噬菌体抗体是指在其表面表达有Fab抗体或单链抗体(scFv)的噬菌体.用基因克隆技术将B细胞全套可变区基因克隆出来, 组装到表达载体内并表达到噬菌体表面形成噬菌体抗体的群体, 即为噬菌体抗体库[1].经特定抗原或细胞筛选后, 便可获得特异性抗体.噬菌体抗体库的筛选是关键环节和步骤[2, 3].

关键词：噬菌体库抗体抗体筛选肿瘤

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利用噬菌体库筛选IL-6拮抗剂及功能研究

中华放射医学与防护杂志 2003年第8期 590-590页

目的以人sIL-6R为靶分子,利用噬菌体随机15肽库筛选其亲和短肽,结合计算机模拟分析,获得具有抑制IL-6/IL-6R结合作用的短肽序列,作为IL-6拮抗剂. 方法通过亲和筛选,获得一组sIL-6R特异亲和序列.测定序列,结合计算机模拟,选取具有潜在拮... 详细信息

目的以人sIL-6R为靶分子,利用噬菌体随机15肽库筛选其亲和短肽,结合计算机模拟分析,获得具有抑制IL-6/IL-6R结合作用的短肽序列,作为IL-6拮抗剂. 方法通过亲和筛选,获得一组sIL-6R特异亲和序列.测定序列,结合计算机模拟,选取具有潜在拮抗功能的2条肽(命名为pT1、pT2).合成短肽,进行ELISA竞争抑制实验和细胞增殖抑制实验. 结果 pT1、pT2均可抑制IL-6/sIL-6R的结合.pT1、pT2可抑制XG-7细胞的增殖,并且这种抑制作用随着合成肽浓度的增高而增强, pT1、pT2不影响7TD1细胞的增殖. 结论利用亲和筛选并结合计算机模拟从随机15肽库中获得可抑制IL-6/sIL-6R结合的短肽,并可抑制IL-6依赖细胞XG-7的增殖.

关键词： IL-6 噬菌体库拮抗剂

东亚飞蝗TLR7-scFv抗体库的构建及其筛选

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东亚飞蝗TLR7-scFv抗体库的构建及其筛选

作者：刘自强重庆理工大学

学位级别：硕士

TLR7是TOLL家族成员,在特异性检测单链病毒RNA,诱导IFN参与的促炎细胞因子释放与机体免疫调控中有重要的作用。单链抗体（Single-chain fragment variable,scFv）属基因工程抗体,较天然抗体具有分子量小、组织穿透能力良好、半衰期短、... 详细信息

TLR7是TOLL家族成员,在特异性检测单链病毒RNA,诱导IFN参与的促炎细胞因子释放与机体免疫调控中有重要的作用。单链抗体（Single-chain fragment variable,scFv）属基因工程抗体,较天然抗体具有分子量小、组织穿透能力良好、半衰期短、易代谢,不易产生体内堆积等特点。此外,scFv只保留了识别抗原的可变区没有Fc区域,使其具有高度特异性和低免疫原性的优点,在作为抗体药物及免疫检测工具等方面都具有广泛的应用前景。本研究主要工作包括:构建东亚飞蝗TLR7-scFv噬菌体文库,采用ELISA法从中筛选高亲和力、高特异性的TLR7-scFv。所获得的结果为后续以东亚飞蝗为模型探索TLR7免疫相关功能奠定了良好的工作基础。1.东亚飞蝗TLR7-scFv噬菌体展示文库的构建从培养的TLR7基因工程菌株中纯化TLR7重组蛋白,按100μg TLR7/只/次进行小鼠免疫,间周免疫,共四次。收集血清,测得效价大于64000。从小鼠脾组织提取总RNA,经RT-PCR扩增、片段融合,获得scFv。将p CANTAB5E载体和scFv基因连接,电激转化TG1细胞,构建出东亚飞蝗p CANTAB5E-scFv/TG1文库。再经噬菌体包装,获得了TLR7-scFv噬菌体文库,其滴度为8.9×10 pfu。随机挑取文库转化子进行菌落PCR和酶切鉴定,结果显示被检转化子重组率为100%,提示文库构建成功。2.TLR7-scFv的富集与筛选ELISA法包被纯化的TLR7重组蛋白,按照0.1%、0.2%、0.3%的吐温浓度依次增加进行噬菌体淘选。经三轮筛选后,回收率趋于稳定。对第三轮筛选结果进行菌落PCR和酶切鉴定,被检测单克隆阳性率为100%。随机挑选50个阳性单克隆菌株质粒进行测序,得到5种不同的序列。同源性分析显示,这5种序列同源性在81.23%～89.49%之间,其中具有相同序列的质粒最高比例53%。3.TLR7-scFv的ELISA活性检测将第三轮筛选得到的5种不同序列的单克隆TLR7-scFv进行周质空间的小量表达。以HB2151菌株为阴性对照,用夹心ELISA检测TLR7-scFv活性,发现scFv-9活性最高。随后再用间接ELISA进行验证,结果与夹心ELISA一致。4.TLR7-scFv的Western blot特异性检测对ELISA活性最高的scFv-9进行Western blot检测,结果显示scFv-9可以与TLR7重组蛋白和蝗虫血细胞总蛋白特异性结合。

关键词： TLR7 单链抗体噬菌体库 ELISA Western blot

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人体肠道噬菌体的研究与应用

微生物学通报 2021年第9期48卷 3314-3329页

作者：刘聪邢博陈婉桐李俊桦肖敏凤深圳华大生命科学研究院广东深圳518083 中国科学院大学生命科学学院北京100049 华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006 深圳市未知病原体应急检测重点实验室广东深圳518083

肠道是人体内微生物定殖最丰富的部位。近年来,随着肠道菌群与人体健康疾病关联研究的蓬勃发展,肠道噬菌体也逐渐引起关注。然而,相关信息技术和实验技术发展的滞后在一定程度上限制了肠道噬菌体的科学研究进程。因此,本文首先回顾了近... 详细信息

肠道是人体内微生物定殖最丰富的部位。近年来,随着肠道菌群与人体健康疾病关联研究的蓬勃发展,肠道噬菌体也逐渐引起关注。然而,相关信息技术和实验技术发展的滞后在一定程度上限制了肠道噬菌体的科学研究进程。因此,本文首先回顾了近几年来肠道噬菌体研究领域所开发或采用的计算和实验方法,包括噬菌体的测序数据分析和噬菌体的分离纯化等。随后,本文就肠道噬菌体的分类、肠道内噬菌体与细菌的互作及肠道噬菌体在人体疾病干预中的应用展开了讨论。最后,本文展望了肠道噬菌体研究在数据和实体资源、信息和实验技术、与肠道菌群的互作、干预和治疗人体疾病各方面的一系列挑战和机遇。

关键词：病毒组噬菌体数据库肠道噬菌体挖掘噬菌体库微生物疗法肠道微生态慢病干预

基于靶向结合的食源性诺如病毒富集与检测研究进展

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病毒学报 2019年第6期35卷 978-983页

作者：张乐吴清平吴克刚薛亮张菊梅广东工业大学轻工化工学院广州510070 广东省微生物研究所广东省科学院省部共建华南应用微生物国家重点实验室广东省菌种保藏与应用重点实验室广东省微生物应用新技术公共实验室广州510070

诺如病毒(Noroviruses,NoVs)是全球急性胃肠炎的重要食源性病原。复杂基质的前处理技术一直是食品安全领域中病毒检测研究的重点和难点。除了絮凝沉淀、超速离心、超滤浓缩、电荷膜过滤等常用的非特异性富集技术外,基于分子互作的靶向... 详细信息

诺如病毒(Noroviruses,NoVs)是全球急性胃肠炎的重要食源性病原。复杂基质的前处理技术一直是食品安全领域中病毒检测研究的重点和难点。除了絮凝沉淀、超速离心、超滤浓缩、电荷膜过滤等常用的非特异性富集技术外,基于分子互作的靶向病毒富集技术已成为了近年来的研究热点。常用的靶向结合种类包括抗原-抗体结合、病毒-受体结合、筛选特异性的核酸适配体、基于噬菌体表面展示技术筛选特异性的多肽、分子印迹等。因此,本文对近年来诺如病毒靶向富集技术的研究进展进行了综述,以期为完善食源性病毒快速检测技术提供参考。

关键词：诺如病毒(NoVs) 靶向结合免疫磁珠核酸适配体受体噬菌体库分子印迹

高亲和力CD20抗体的制备及生物学功能鉴定

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高亲和力CD20抗体的制备及生物学功能鉴定

作者：陈琳第二军医大学

学位级别：硕士

非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin’s Lymphoma NHL)是临床最常见的淋巴系统恶性肿瘤,其中B细胞来源约占85%。人CD20分子又称为B1或Bp35,仅表达于所有的前B细胞、成熟B细胞和超过95%的恶性B细胞表面,而不表达于造血干细胞、浆细胞和其他正常... 详细信息

非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin’s Lymphoma NHL)是临床最常见的淋巴系统恶性肿瘤,其中B细胞来源约占85%。人CD20分子又称为B1或Bp35,仅表达于所有的前B细胞、成熟B细胞和超过95%的恶性B细胞表面,而不表达于造血干细胞、浆细胞和其他正常组织中。其与抗体结合后无显著内化和脱落,也不因与抗体结合而发生抗原调变,从而成为治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的理想靶点。 Rituximab(C2B8)是美国基因科技公司研发的以人CD20分子为靶点的人鼠嵌合型IgG1免疫球蛋白,可特异性地与B淋巴细胞表面CD20抗原结合。主要通过以下两种机制发挥抗肿瘤作用:诱导补体介导的细胞毒作用(CDC)和诱导抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。尽管Rituximab已显示良好的治疗效果,但其临床反应率仅为50%左右,完全缓解率只有10%,因此进一步研制出具有更强抗肿瘤活性的CD20抗体对临床治疗具有重要的意义。在前期研究中,本实验室获得了Rituximab/CD20抗原肽的复合物共晶,在此基础上通过计算机模拟辅助设计得到三个亲和力提高的突变体:Rituximab(Rituximab重链57位D突变成R)、RituximabY102R(Rituximab重链102位Y突变成R)、Rituximab(Rituximab重链102位Y突变成S)。经体外实验表明:与Rituximab相比,这些亲和力提高的突变体CDC活性没有改变,而ADCC活性显著增强,显示出较亲本抗体Rituximab更强的抗肿瘤活性。在前期实验中,我们还成功获得一株CDC活性显著高于Rituximab的抗CD20人源化抗体hu8E4,经体内实验证实:hu8E4的抗肿瘤作用比Rituximab明显增强。计算机模拟辅助设计提高抗体的亲和力,需要在已获得抗原抗体复合物共晶的基础上,这往往难于获得。而过去研究表明采用传统杂交瘤技术制备的CD20单克隆抗体均与Rituximab具有相似的结合表位,因此我们设想能否通过在具有相似抗原结合表位的单克隆抗体间对应移植亲和力提高的突变位点,从而达到提高抗体亲和力的目的。在本课题研究中,我们利用噬菌体展示技术对hu8E4的抗原表位进行筛选和鉴定,发现其同样与Rituximab具有相似的结合表位。于是我们尝试将能够提高Rituximab亲和力的三个突变位点:D57R、Y102R、Y102S,对应移植到hu8E4上;与此同时,为进一步验证该方法的有效性,我们也将这三个突变位点对应移植到与Rituximab具有相似结合表位的嵌合抗体2H7上。实验结果表明,在得到的hu8E4三个突变体中,hu8E4和hu8E4的亲和力获得了提高,但hu8E4Y102S的亲和力下降;而在C2H7的三个突变体中,C2H7和C2H7的亲和力提高,C2H7的亲和力下降。重要的是,我们发现在hu8E4和C2H7的突变体上,亲和力提高的突变位点是一致的。经体外实验表明:hu8E4和C2H7突变体分别具有与亲本抗体相似的CDC活性,但它们的ADCC活性明显增强。综上所述,我们获得了人源化CD20抗体hu8E4的高亲和力突变体,经体外生物学功能鉴定证实具有更强的抗肿瘤作用。而这种在具有相似抗原结合表位的单克隆抗体间对应移植亲和力提高的突变位点,从而提高抗体亲和力及其活性的方法,具有潜在的应用价值。

关键词：非霍奇金淋巴瘤 CD20 Rituximab 噬菌体库抗原表位亲和力

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肺癌细胞特异性结合肽的体内筛选及初步鉴定

山东医药 2008年第33期48卷 27-28页

作者：潘琴石磊潘雪刁巫玮金桂芳臧林泉广东药学院广东广州510006

目的筛选能与肺癌细胞特异性结合的多肽并初步鉴定其亲和力和特异性。方法用人肺癌细胞A549使裸鼠致瘤,尾静脉注射肽库。取荷瘤鼠的肿瘤组织,用体内噬菌体展示技术进行筛选;经过3轮体内筛选,获得在肿瘤组织中富集的噬菌体;利用ELISA和... 详细信息

目的筛选能与肺癌细胞特异性结合的多肽并初步鉴定其亲和力和特异性。方法用人肺癌细胞A549使裸鼠致瘤,尾静脉注射肽库。取荷瘤鼠的肿瘤组织,用体内噬菌体展示技术进行筛选;经过3轮体内筛选,获得在肿瘤组织中富集的噬菌体;利用ELISA和细胞免疫化学DAB染色法初步鉴定各克隆亲和力、特异性;对阳性克隆行DNA测序,利用生物信息学对此多肽进行分析、比对。结果随机挑选的10个单克隆中,8个均对A549细胞具有较高亲和力,其中3号克隆亲和力最高,其可特异性结合肺癌细胞A549和NCI-H1299,且对A549的亲和力强于NCI-H1299。DNA测序结果显示该序列与美国国立生物技术信息中心(NCBI)GenBank DNA序列数据库和Swiss-Prot蛋白数据库中的已知基因和蛋白无同源性。结论筛选出了能与肺癌细胞特异性结合的多肽。

关键词：噬菌体体内展示技术噬菌体库肺癌细胞特异性结合肽