检索结果-南通市图书馆

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

尘肺病噬菌体单链抗体库的构建及鉴定

郑州大学学报（医学版） 2011年第6期46卷 852-855页

作者：翟伟郝长付高彬姚武郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室郑州450001

目的:构建具有良好多样性的人尘肺病噬菌体单链抗体(ScFv)库。方法:收集25例尘肺病患者外周血标本共50mL,密度梯度离心法分离淋巴细胞,Trizol法提取总RNA,逆转录后参考文献设计并合成半巢式PCR引物,扩增抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基... 详细信息

目的:构建具有良好多样性的人尘肺病噬菌体单链抗体(ScFv)库。方法:收集25例尘肺病患者外周血标本共50mL,密度梯度离心法分离淋巴细胞,Trizol法提取总RNA,逆转录后参考文献设计并合成半巢式PCR引物,扩增抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,Linker连接VH和VL,继而连接到噬菌体载体pCANTAB-5E中,连接产物转入感受态大肠杆菌TG1,超感染辅助噬菌体M13KO7,构建噬菌体ScFv库。结果:扩增出VH和VL基因序列并有效地连接,经转化和超感染,构建了库容为2.4×107pfu/mL的ScFV库。结论:成功构建人尘肺病噬菌体ScFV库。

关键词：尘肺噬菌体单链抗体库单链抗体

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

T载体在噬菌体单链抗体库中的应用

中国新医药 2004年第6期3卷 4-5页

作者：吕勇刚窦科峰赵爱志韩月恒刘杰陈刚陶开山吴昱彤药立波第四军医大学西京医院710032 第四军医大学生化教研室710032 第四军医大学药理教研室710032 西安交通大学附属一院第四军医大学唐都医院

目的将T载体用于提高PCR产物的克隆效率，以构建大库容量的噬菌体单链抗体库。方法用传统的直接酶切的方法处理抗体轻链，直接连到经相同酶切的表达载体构建轻链抗体库；同时制备T载体，将抗体轻链克隆于T载体建成T载体克隆文库。然... 详细信息

目的将T载体用于提高PCR产物的克隆效率，以构建大库容量的噬菌体单链抗体库。方法用传统的直接酶切的方法处理抗体轻链，直接连到经相同酶切的表达载体构建轻链抗体库；同时制备T载体，将抗体轻链克隆于T载体建成T载体克隆文库。然后再把轻链从T载体上切下来克隆到噬粒表达载体pDAN5，构建轻链抗体库。比较两种方法的效率。结果制备的T载体质量较好，可以满足建库所需，轻链T载体库为28×10^8，经过T载体过渡比直接酶切连接效率要高出将近1000倍。结论 T载体的应用较好的解决了PCR产物克隆困难的问题。能够用于大容量噬菌体单链抗体库的构建。

关键词：噬菌体单链抗体库 T载体克隆 PCR 酶切法

维普期刊数据库评论

在线全文

维普期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

高亲和力抗藻毒素单链抗体的快速筛选

中国食品学报 2017年第10期17卷 274-279页

作者：党辉陈佩张秋香刘小鸣赵建新陈永泉张灏陈卫江南大学食品学院江苏无锡214122 陕西师范大学食品工程与营养科学学院西安710062 陕西广播电视大学西安710062

蓝藻水华引发的微囊藻毒素(MC-LR)与肿瘤促进作用有直接关系,检测方法主要是色谱学方法和免疫学方法。以碳化二亚胺法将MC-LR与磁珠直接偶联,采用磁珠液相筛选法从噬菌体单链抗体库中筛选抗MCLR的单链抗体(scFv),结果成功富集、筛选到抗... 详细信息

蓝藻水华引发的微囊藻毒素(MC-LR)与肿瘤促进作用有直接关系,检测方法主要是色谱学方法和免疫学方法。以碳化二亚胺法将MC-LR与磁珠直接偶联,采用磁珠液相筛选法从噬菌体单链抗体库中筛选抗MCLR的单链抗体(scFv),结果成功富集、筛选到抗MC-LR的阳性克隆,阳性率达到95%。通过基因测序获得3株阳性克隆,其中与MC-LR结合活性最好的阳性克隆的IC_(50)为0.6 ng/m L。结果表明,将半抗原与磁珠直接偶联,可以灵敏、快速地从噬菌体抗体库中分离目标抗体。

关键词：磁珠噬菌体单链抗体库微囊藻毒素筛选单链抗体

抗产气荚膜梭菌ι毒素Phage-ScFv库的构建与筛选

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国兽医学报 2017年第2期37卷 243-249页

作者：王琳刘思远杜乐妍景心怡赵宝华河北师范大学生命科学学院河北石家庄050016

选取经产气荚膜梭菌ι毒素免疫且抗体效价较高的小鼠,提取脾脏mRNA,通过PT-PC技术,分别获得340,325bp的重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)。利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得大小为750bp的VH-Linker-VL单链抗体基因(ScFv)。利用One S... 详细信息

选取经产气荚膜梭菌ι毒素免疫且抗体效价较高的小鼠,提取脾脏mRNA,通过PT-PC技术,分别获得340,325bp的重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)。利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得大小为750bp的VH-Linker-VL单链抗体基因(ScFv)。利用One Step Cloning Kit试剂盒将ScFv基因片段与噬菌粒载体pCANTAB5E连接,构建库容约为3.5×106抗ι毒素噬菌体初级抗体库。以Ia、Ib为抗原进行Phage-ScFv表面展示文库的5轮亲和富集筛选,最终阳性率均可达70%。选取亲和力最强的3株阳性抗体(Ia-4、Ia-8和Ib1)进行可溶性表达,为ι毒素特异性抗体的大量制备奠定基础,并对产气荚膜梭菌ι毒素感染病例的检测和临床治疗研究具有一定的理论价值和实践意义。

关键词：产气荚膜梭菌c毒素 Ia Ib 单链抗体噬菌体单链抗体库

抗副溶血弧菌极鞭毛蛋白FlaB单链抗体的制备

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

抗副溶血弧菌极鞭毛蛋白FlaB单链抗体的制备

作者：杨新福建农林大学

学位级别：硕士

副溶血弧菌是一种广泛存在于水环境中的革兰氏阴性嗜盐菌,更是一种常见的食源性病原菌,可污染多种水产品,并引起人的食物中毒。其鞭毛基因系统复杂,参与粘附作用,包括周身鞭毛和极性鞭毛两种形式。鞭毛基因系统包括约57个基因和3个开放... 详细信息

副溶血弧菌是一种广泛存在于水环境中的革兰氏阴性嗜盐菌,更是一种常见的食源性病原菌,可污染多种水产品,并引起人的食物中毒。其鞭毛基因系统复杂,参与粘附作用,包括周身鞭毛和极性鞭毛两种形式。鞭毛基因系统包括约57个基因和3个开放阅读框,极性鞭毛系统与周身鞭毛系统的结构与装配成分并不分享。本实验试图制备出一株抗其极鞭毛蛋白FlaB的高亲和力的单链抗体,希望建立一种更快速检测VP的检测手段。本实验首先从VP基因组中PCR扩增出flaB基因,并构建出重组质粒pET32a(+)-flaB。将该质粒转化宿主菌E. coli BL21( DE3 ),利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白FlaB,经Ni2+-NTA纯化。以纯化的目的蛋白作抗原免疫BalB/C小鼠, ELISA间接法检测抗血清的效价,效价达到后提取总RNA,通过RT-PCR反转录成cDNA、然后以cDNA模板PCR获得抗体重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL,再用15氨基酸连接短肽Linker连接VH、VL组装成有活性的scFv基因,再将scFv基因构建到噬菌体载体pCANTAB-5E上,转化大肠杆菌TG1,实现与cpⅢ蛋白的融合表达,建立丝状噬菌体单链抗体展示库。高库容量的噬菌体抗体库建立后,通过3～5轮的富集淘选和ELISA检测,最终选出一株亲和力高、稳定性强的单链抗体噬菌体,再将此噬菌体侵染大肠杆菌HB2151,实现单链抗体的可溶性表达。

关键词：极鞭毛蛋白单链抗体噬菌体单链抗体库

抗OX40单抗研制及抗CD47单抗联合用药探究

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

抗OX40单抗研制及抗CD47单抗联合用药探究

作者：侯小娟中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

肿瘤免疫治疗是目前单克隆抗体的一个主要发展方向。以PD1-PDL1通路为代表的免疫检查点抗体在临床上的巨大成功使更多的与免疫细胞激活相关靶点的抗体药物的研发成为热点。其中,OX40、CD47两个免疫系统相关分子,被逐步验证可以作为有效... 详细信息

肿瘤免疫治疗是目前单克隆抗体的一个主要发展方向。以PD1-PDL1通路为代表的免疫检查点抗体在临床上的巨大成功使更多的与免疫细胞激活相关靶点的抗体药物的研发成为热点。其中,OX40、CD47两个免疫系统相关分子,被逐步验证可以作为有效的治疗性抗体靶点。OX40(又称CD134、TNFRSF4、ACT35)是表达于活化的CD4+T、CD8+T细胞表面的激活性受体。OX40信号可以激活下游的NF-κB、PI3K和PKB通路,这些通路的持续激活最终能够延长T细胞的存活,促进T细胞的增殖。OX40广泛表达于慢性炎症及肿瘤部位的T细胞上。其配体OX40L能够促进B细胞的活化及抗体产生。两者能在活化的T细胞和B细胞之间进行双向信号转导,具有强大的生物学功能。因此,研发抗OX40抗体对肿瘤治疗具有重要的现实意义。CD47(又称整联蛋白、卵巢癌标志物)是表达于多种肿瘤细胞表面并作用于巨噬细胞及DC细胞的免疫检查点分子,通过与巨噬细胞表面的SIRPα结合向其传递“Don′t eat me”信号,实现免疫逃逸。阻断CD47-SIRPα通路可以促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬,同时还可以提高肿瘤特异性抗原的免疫递呈,激活特异性T细胞对肿瘤细胞的杀伤,达到同时激活固有免疫和获得性免疫应答的效果。本课题主要围绕免疫抗肿瘤抗体药物的发现和评价,一方面尝试利用大容量抗体库筛选技术获得抗OX40激动型抗体,为肿瘤的免疫治疗提供新的候选分子;另一方面针对已经获得的一株抗CD47功能抗体,探索其与其它靶向抗体联合抗肿瘤的应用。本课题的第一部分是围绕免疫抗肿瘤抗体药物的发现,以T细胞表面共刺激分子OX40为靶点,筛选抗OX40单抗并进行初步鉴定。依托已构建的大容量全合成全人源噬菌体单链抗体库平台,以OX40为抗原进行多轮多次的固相筛选。经过3轮条件渐进严苛的筛选后,得到8株阳性克隆,其中一株得到极好的富集;所有阳性克隆通过基因工程改造成全抗体形式,形成重组质粒。重组质粒按照一定的比例转染HEK293-F细胞进行全抗体的瞬时表达;并基于AKTA系统对全抗体进行纯化。之后分别通过以下方法验证了全抗体的特性。第一,通过ELISA验证了全抗体与抗原OX40在分子水平上的结合活性;第二,通过间接免疫荧光验证了全抗体与细胞表面抗原的结合活性;第三,通过流式细胞术验证了全抗体与细胞表面抗原的结合活性和特异性;第四,采用ELISA方法测定了全抗体的特异性;第五,通过血清放置实验验证了全抗体的血清稳定性;第六,通过BIAcore TM3000初步测定了全抗体亲和力。实验结果显示,通过3轮噬菌体单链抗体库固相筛选后,得到8株阳性单链抗体,scFv-1在筛选过程中富集率达到了95%;8株中有5株顺利改造成全抗体并表达纯化。对各抗体分子的特性进行探究发现,OX40mab-4、OX40mab-8与抗原的结合活性较差,OX40mab-5、OX40mab-6的特异性较差,因此这4株抗体在鉴定过程中被逐渐淘汰。相比于其他4株抗体,OX40mab-1具有较好的结合活性,与OX40结合的EC50为0.015μM,特异性、血清稳定性也较好,亲和力为251 nM。因此确定OX40mab-1作为后续研究的候选抗体分子。本课题的第二部分是围绕免疫抗肿瘤抗体药物的评价,以本室已获得的一株高亲和力全人源抗CD47特异性抗体AMMS4-G4为研究对象,探究该抗体在肿瘤模型体内联合其他靶向抗体的药效。该抗体可以阻断CD47-SIRPα的结合,并且能够有效促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。体内试验已证实该抗体独立给药时,能够显著延长白血病模型小鼠的生存期,有效清除模型动物体内的白血病细胞;因此,本课题基于以上研究背景,探究了AMMS4-G4在肿瘤小鼠模型中联合其他靶向抗体联合用药的药效,期望能够探索出此抗体在肿瘤应用中的新方法,为临床治疗奠定基础。本课题选择了三种联合靶向抗体:A2C1、Herceptin和Rituximab。A2C1是本室获得的另一株靶向人EGFR的阻断型抗体,正在开展针对人结直肠癌的临床试验;Herceptin是一株靶向人HER2的人源化单抗,临床上主要用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌;Rituximab是一株靶向人CD20的人鼠嵌合单抗,临床上主要用于治疗CD20阳性的非霍奇金淋巴瘤。基于AMMS4-G4和上述三种靶向抗体的特性,本课题构建了以下肿瘤动物模型。分别是同时表达人CD47和EGFR的人结肠癌细胞Lovo荷瘤裸鼠模型;同时表达人CD47和HER2的人卵巢癌细胞Skov3荷瘤裸鼠模型;同时表达人CD47和CD20的淋巴瘤Raji肿瘤模型,分别用于考察AMMS4-G4和A2C1、Herceptin和Rituximab联合用药的治疗效果。抗CD47治疗性抗体联合用药药效评价主要从以下几个方面展

关键词： OX40 CD47 单克隆抗体噬菌体单链抗体库特异性