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2’-氟-2-’脱氧腺苷的核苷磷酸化酶催化合成技术研究

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2’-氟-2-’脱氧腺苷的核苷磷酸化酶催化合成技术研究

作者：滕海东浙江大学

学位级别：硕士

核苷类似物已经被广泛地用于癌症和抗病毒的治疗,但是其昂贵的药物成本阻碍了广泛的生物学研究以及治疗应用。传统的化学合成方法步骤多,耗时长,还需要进行技术难度高的糖基活化以及对糖苷形成的立体和区域选择性控制。因此,能在环境友... 详细信息

核苷类似物已经被广泛地用于癌症和抗病毒的治疗,但是其昂贵的药物成本阻碍了广泛的生物学研究以及治疗应用。传统的化学合成方法步骤多,耗时长,还需要进行技术难度高的糖基活化以及对糖苷形成的立体和区域选择性控制。因此,能在环境友好的条件下有效合成核苷类似物的生物催化提供了更有吸引力的替代途径,从而使工艺更有效清洁。本文选取胸苷磷酸化酶（Thymidinephosphorylase,TP）与嘌呤核苷磷酸化酶（Purinenucleosidephosphorylase,PNP）作为生物催化剂,催化 2’-氟-2’-脱氧尿苷与腺嘌呤进行转糖基化反应生成2’-氟-2’-脱氧腺苷。首先根据大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶的空间结构,选取PNP原始序列上的活性位点进行定点饱和突变,利用高效液相色谱检测产物的浓度,筛选出酶活表现最佳的突变株,酶活比野生型菌株提升了 47.6%。其次探索并优化了突变株的最佳培养条件:接种2%（v/v）LB的活化菌液,加入卡那霉素至终浓度为40 mg/L,在37℃,200 rpm摇床里培养至菌液OD600=0.5Abs,加入IPTG至终浓度为0.9mM,在33℃,200 rpm摇床里继续培养12h。并在5L发酵罐中对工程菌进行发酵试验,培养共得到198 g湿菌体。最后,对筛选出的表现最优异的突变株MF13与TP催化2’-氟-2’-脱氧尿苷和腺嘌呤的转糖基化反应条件进行优化,得到最佳反应条件是:反应温度48℃,100 mM磷酸缓冲溶液pH=7.0,2’-氟-2’-脱氧尿苷25 mM,腺嘌呤62.5 mM,投入的TP酶液2mL,MF13酶液2mL,反应产率可以达到60.2%。在优化的反应条件的基础上,将反应体系放大了 50倍,在反应36h后产物浓度3.85g/L,产率达到了 57.4%。

关键词： 2’-氟-2’-脱氧腺苷转糖基化反应胸苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶定点饱和突变

过表达PNP对肌苷生产菌合成利巴韦林的影响

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天津科技大学学报 2015年第3期30卷 14-18页

作者：杨书尧刘莉马跃超陈宁谢希贤代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室天津科技大学生物工程学院天津300457

采用PCR技术从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168基因组DNA中扩增其编码嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase,PNP)的两个基因deo D(PNP702)和pup G(PNP816).以肌苷生产菌枯草芽孢杆菌(B.,subtilis)Q60为出发菌株,分别采用胞内与胞外分泌过表达PNP的方式构建4株重组菌株,通过外源添加底物1,2,4–三氮唑–3–羧氨酰(TCA)的方式直接合成利巴韦林.摇瓶发酵数据显示,胞内过表达PNP702和PNP816的利巴韦林产量分别为(8.33±0.57),g/L和(11.00±0.38),g/L.胞外分泌过表达PNP702和PNP816的利巴韦林产量分别为(9.06±0.17),g/L和(12.67±0.60),g/***816的催化效率高于PNP702,胞外分泌过表达比胞内过表达高,其中胞外分泌过表达PNP816重组菌Q60/p BSApup G最高,比出发菌(2.02±0.72),g/L提高了5.3倍.

关键词：利巴韦林肌苷嘌呤核苷磷酸化酶发酵

参环毛蚓体内核苷磷酸化酶的活性测定及动力学分析

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中药新药与临床药理 2014年第6期25卷 721-724页

作者：李菁龚玲李薇卢瑞珊陈立红迟玉广广州中医药大学中药学院广东广州510006

目的建立参环毛蚓体内嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）的检测方法,以肌苷为底物,评价该酶的活性。方法采用HPLC法,色谱条件：Ecosil C18-AQ柱（250 mm×4.6 mm,5μm）,流动相为10 mmol·L^-1磷酸二氢铵缓冲液（p H4.5）和甲醇,梯度洗脱,流速为0... 详细信息

目的建立参环毛蚓体内嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）的检测方法,以肌苷为底物,评价该酶的活性。方法采用HPLC法,色谱条件：Ecosil C18-AQ柱（250 mm×4.6 mm,5μm）,流动相为10 mmol·L^-1磷酸二氢铵缓冲液（p H4.5）和甲醇,梯度洗脱,流速为0.8 m L·min^-1,柱温为室温,检测波长254 nm,用底物肌苷与组织粗蛋白提取液在室温孵育30 min,沸水煮5 min终止反应,12000 r·min^-1离心10 min,取上清过滤后进行HPLC分析,以Origin Pro 8.5软件作图,计算酶动力学参数。结果酶反应中产物次黄嘌呤在0.5-40μmol·L^-1范围内呈良好的线性关系（r=0.9996）;精密度小于3.5%,回收率大于80%。PNP酶动力学参数：Vmax为0.015nmol·min^-1·mg^-1,Km为19.8μmol·L^-1。结论成功构建了参环毛蚓体内次黄嘌呤代谢酶活性测定相关的实验体系,该法所得数据稳定可靠,可准确反映关键酶活性的动态变化。

关键词：参环毛蚓次黄嘌呤肌苷嘌呤核苷磷酸化酶高效液相色谱法

PNP基因多态性与地方性砷中毒易感性的关系研究

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河北医药 2013年第17期35卷 2565-2568页

作者：侯文胜张丽芳裴秋玲中国石油集团石油职业卫生技术服务中心河北省廊坊市065000 山西医科大学公共卫生学院毒理学教研室

目的探讨砷代谢相关酶嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)单核苷酸第2外显子多态性与地方性砷中毒患病风险的关系。方法采用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对79名地方性砷中毒患者和110名正常人群PNP基因第2外显子的突变情况进行初筛,... 详细信息

目的探讨砷代谢相关酶嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)单核苷酸第2外显子多态性与地方性砷中毒患病风险的关系。方法采用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对79名地方性砷中毒患者和110名正常人群PNP基因第2外显子的突变情况进行初筛,并进一步对异常带型进行直接DNA测序,以确定突变位点及类型。对多态性进行单因素分析和多因素非条件Logistic回归分析。结果病例组15位密码子GAA→AAA突变、51位密码子GGT→C/AGT突变和51位密码子GGT→AGT突变的发生率(11.4%)低于对照组(19.1%);病例组20位密码子CAC→CAT突变的发生率(10.1%)低于对照组(17.3%);病例组57位密码子CCC→CCT突变的发生率(22.8%)低于对照组(38.2%),但五种突变差异均无统计学意义(P>0.05)。在多因素分析中调整年龄、性别等因素后,PNP基因多态性与地方性砷中毒发病仍无统计学意义,与单因素分析的结果相同。结论虽然病例组PNP基因第2外显子上的多态性发生率低于对照组,但是这种差异没有统计学意义,出现这种情况的原因可能与分析的样本量较小,或者是有关的多态性位点在PNP基因其他的外显子或非编码区上有关。

关键词：地方性砷中毒嘌呤核苷磷酸化酶聚合酶链反应-单链构象多态性基因测序

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甜菜碱对枯草芽孢杆菌合成利巴韦林的影响

天津科技大学学报 2009年第4期24卷 14-17页

作者：邢晨光赵希景谢希贤陈宁天津科技大学生物工程学院天津300457 江苏诚意药业有限公司淮安223002

以枯草芽孢杆菌TM903为供试菌株,采用摇瓶分批补料发酵的培养方式,考察了甜菜碱添加量对枯草芽孢杆菌合成利巴韦林及其合成途径中嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)活力的影响.结果表明,初始培养基添加0.7.g/L的甜菜碱,发酵36 h后每间隔3 h流加0... 详细信息

以枯草芽孢杆菌TM903为供试菌株,采用摇瓶分批补料发酵的培养方式,考察了甜菜碱添加量对枯草芽孢杆菌合成利巴韦林及其合成途径中嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)活力的影响.结果表明,初始培养基添加0.7.g/L的甜菜碱,发酵36 h后每间隔3 h流加0.1 g/L甜菜碱,可显著提高PNPase的相对酶活,并且使利巴韦林的产量达4.21.g/L,比未添加前提高了47.2%.

关键词：利巴韦林嘌呤核苷磷酸化酶枯草芽胞杆菌甜菜碱

pcDNA3.0/PNP-CD和pcDNA3.0/PNP表达载体的克隆和表达

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肿瘤防治杂志 2004年第11期11卷 1125-1129页

作者：蔡晓坤林菊生刘址忠陶璐薇梁扩寰华中科技大学同济医学院附属同济医院消化内科肝病研究所湖北武汉430030

目的 :构建新型PNP/Mep dR自杀基因系统的融合和单基因表达载体。方法 :利用DNA重组技术制备融合自杀基因PNP CD ,将其和PNP单基因分别插入真核表达载体pcDNA 3 0中 ,构建融合与单自杀基因表达载体pcDNA 3 0 /PNP CD和pcD NA 3 0 /PN... 详细信息

目的 :构建新型PNP/Mep dR自杀基因系统的融合和单基因表达载体。方法 :利用DNA重组技术制备融合自杀基因PNP CD ,将其和PNP单基因分别插入真核表达载体pcDNA 3 0中 ,构建融合与单自杀基因表达载体pcDNA 3 0 /PNP CD和pcD NA 3 0 /PNP ;酶切、PCR及测序鉴定两重组体。结果 :成功构建了两个新型自杀基因载体并实现在HepG2肝癌细胞株中的表达。结论 :两个新型自杀基因表达载体 ,尤其是PNP CD融合自杀基因载体 ,是肿瘤基因治疗中广谱、高效的治疗载体。

关键词：大肠肝菌嘌呤核苷磷酸化酶基因表达遗传载体克隆,分子基因疗法

水平转移方式起源的陆生植物基因PNP的鉴定及其在水稻中的功能研究

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水平转移方式起源的陆生植物基因PNP的鉴定及其在水稻中的功能研究

携带ePNP基因的减毒伤寒沙门菌的构建及目的基因在胰腺癌细胞中的表达

江苏省遗传学会2013年学术研讨会

作者：王雨杨泽峰徐辰武扬州大学江苏省作物遗传生理重点实验室/教育部植物功能基因组学重点实验室

嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase）是磷酸化酶超级家族的一个亚群,可逆地催化嘌呤核苷磷酸解反应,分解成相应的嘌呤碱及核糖-1-磷酸。PNPase是嘌呤补救合成途径的关键酶之一,广泛存在于原核和真核生物中。而陆生植物PNP基因的起源及功能还不... 详细信息

嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase）是磷酸化酶超级家族的一个亚群,可逆地催化嘌呤核苷磷酸解反应,分解成相应的嘌呤碱及核糖-1-磷酸。PNPase是嘌呤补救合成途径的关键酶之一,广泛存在于原核和真核生物中。而陆生植物PNP基因的起源及功能还不清楚。本研究利用生物信息学的方法探讨陆生植物PNP基因家族的起源、扩张模式以及适应性进化,并结合反向遗传学手段研究水稻PNP基因的功能。结果表明陆生植物PNP基因是早期通过一次水平基因转移从细菌中获得,在其祖先物种进化早期经历了正选择作用,并通过获得的一些内含子形成了外显子/内含子的主要结构特征。水稻PNP基因功能研究表明该基因大量地在茎皮中表达,并且表达受到多种非生物胁迫因素的调控。其蛋白产物定位于叶绿体基质中。Ospnp突变体植株和RNAi植株显著矮于野生型,并且表现出缺绿表型。所有的这些结果表明水平基因转移起源的陆生植物PNP基因在其陆生植物祖先基因组中经历的正选择作用对其功能分化及固定具有重要作用。

关键词：嘌呤核苷磷酸化酶水平基因转移正选择作用功能研究

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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苏州大学学报（医学版） 2012年第1期32卷 50-53,57页

作者：林勇刘强陈卫昌苏州大学第一医院消化科江苏苏州215006

目的构建含有pEGFP-C1-PNP质粒的减毒鼠伤寒沙门菌SL3261菌株,检测其在胰腺癌细胞BxPc-3中的表达。方法 PCR扩增得到PNP基因,构建真核表达载体pEGFP-C1-PNP,并进行酶切、PCR和测序鉴定。利用电转化法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门菌SL32... 详细信息

目的构建含有pEGFP-C1-PNP质粒的减毒鼠伤寒沙门菌SL3261菌株,检测其在胰腺癌细胞BxPc-3中的表达。方法 PCR扩增得到PNP基因,构建真核表达载体pEGFP-C1-PNP,并进行酶切、PCR和测序鉴定。利用电转化法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门菌SL3261,进行形态学和表面抗原稳定性检测。含质粒SL3261菌株与BxPc-3细胞体外共培养,利用荧光显微镜观察和RT-PCR检测绿色荧光蛋白的表达和PNP基因的转录。结果目的基因正确连接pEGFP-C1中,并成功转入减毒鼠伤寒沙门菌,感染细胞亦检测到目的基因的表达。结论成功构建了能携带ePNP基因真核表达质粒的SL3261菌株,且该基因能在胰腺癌细胞中正确表达。

关键词：减毒鼠伤寒沙门菌嘌呤核苷磷酸化酶真核表达载体

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ePNP自杀基因载体的构建及其表达

肿瘤学杂志 2009年第4期15卷 303-305页

作者：李克强李文林饶泽昌赵林刘东海唐洪林石小玉宁波市第二医院浙江宁波315000 南昌大学医学院江西南昌330006 江西省医学科学研究所医学生物高技术重点实验室江西南昌330006

[目的]构建稳定表达ePNP(***)的细胞模型,为肿瘤的基因治疗提供实验基础。[方法]提取大肠杆菌***12总DNA,PCR方法克隆大肠杆菌ePNP基因,构建逆转录病毒载体质粒pMSCV-ANGPTL4,鉴定测序。脂质体法将三种逆转录病毒载体pMSCV-ANGPTL4、pVS... 详细信息

[目的]构建稳定表达ePNP(***)的细胞模型,为肿瘤的基因治疗提供实验基础。[方法]提取大肠杆菌***12总DNA,PCR方法克隆大肠杆菌ePNP基因,构建逆转录病毒载体质粒pMSCV-ANGPTL4,鉴定测序。脂质体法将三种逆转录病毒载体pMSCV-ANGPTL4、pVSV、pGAG-POL共转染293-EBNA包装细胞,获得高滴度病毒并感染MDA-MB435细胞。荧光显微镜与RT-PCR检测MDA-MB435细胞ePNP基因的表达。[结果]所克隆的ePNP基因与文献报道一致;成功构建了pMSCV/ePNP重组逆转录病毒载体;ePNP基因在MDA-MB435细胞中获得稳定表达。[结论]pMSCV/ePNP自杀基因载体的成功构建及其表达为ePNP应用于肿瘤基因治疗奠定了基础。

关键词：嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因重组逆转录病毒载体大肠杆菌