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嘌呤核苷磷酸化酶与嘧啶核苷磷酸化酶的融合表达及酶法合成嘌呤核苷类产物

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生物加工过程 2021年第1期19卷 8-16页

作者：徐玲玲康丽峰刘高飞何冰芳储建林南京工业大学药学院江苏南京211816 常州市第一人民医院江苏常州213003 南京工业大学生物与制药工程学院江苏南京211816

将嘌呤核苷磷酸化酶与嘧啶核苷磷酸化酶进行融合,提高生物酶法催化合成克拉屈滨等嘌呤核苷类产物的产率。设计不同的刚性、柔性连接短肽(Linker),将嘧啶核苷磷酸化酶EcUP与嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP连接融合,考察酶融合蛋白的可溶性表达与... 详细信息

将嘌呤核苷磷酸化酶与嘧啶核苷磷酸化酶进行融合,提高生物酶法催化合成克拉屈滨等嘌呤核苷类产物的产率。设计不同的刚性、柔性连接短肽(Linker),将嘧啶核苷磷酸化酶EcUP与嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP连接融合,考察酶融合蛋白的可溶性表达与活性情况。使用EEEEEEKKK短肽连接的融合蛋白EcUP-L4-AmPNP可溶性表达水平较高,并对嘌呤核苷与嘧啶核苷均具有反应活性,对嘌呤核苷的水解率远小于嘧啶核苷。研究发现:融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成克拉屈滨等嘌呤核苷类产物的产率70.4%~98.3%,合成产率比分别加入酶EcUP和酶AmPNP的游离双酶体系提高了约1.5~2.0倍。核苷磷酸化酶的融合蛋白有利于实现高效催化合成嘌呤核苷产物,生物催化合成克拉屈滨等几种嘌呤核苷类产物的产率显著提高。

关键词：嘌呤核苷磷酸化酶嘧啶核苷磷酸化酶融合蛋白嘌呤核苷类产物生物催化

γ射线对红细胞嘌呤核苷磷酸化酶的影响二、酶的某些性质

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实验生物学报 1982年第3期 49-56页

作者：方允中刘智峰军事医学科学院放射医学研究所

正常大鼠和小鼠、经700或1000拉德照射的大鼠和小鼠,纯化它们的红细胞嘌岭核苷磷酸化酶,并研究酶的某些性质。主要结果如下: 1.在纯化过程中,从DEAE-纤维素柱梯度洗脱大鼠酶时,收集管中酶活力高峰相当Tris-醋酸盐缓冲液浓度0.107±0.00... 详细信息

正常大鼠和小鼠、经700或1000拉德照射的大鼠和小鼠,纯化它们的红细胞嘌岭核苷磷酸化酶,并研究酶的某些性质。主要结果如下: 1.在纯化过程中,从DEAE-纤维素柱梯度洗脱大鼠酶时,收集管中酶活力高峰相当Tris-醋酸盐缓冲液浓度0.107±0.003M,而在同样实验条件下,洗脱小鼠酶时酶活力高峰却相当0.213±0.010M。2.大鼠酶反应的Q10小于小鼠酶,但是其米氏常数高于后者。整体照射可使大鼠酶反应的Q10与米氏常数增加,但对于小鼠酶反应的Q10与米氏常数没有影响。3.对氯汞苯甲酸或二氯化汞可抑制红细胞嘌呤核苷磷酸化酶活力,但辐射对酶活力的抑制曲线无显著影响。4.大鼠酶与小鼠酶在聚丙烯酰胺凝胶电泳中相对迁移率是不同的,因而它们的电泳图谱也有差异。整体照射对大鼠酶与小鼠酶在电泳中的相对迁移率无显著影响。5.将大鼠酶与小鼠酶的相对迁移率对数与凝胶浓度作图,可得到两条平行的直线。这表明两种酶的分子量相同,而其净电荷却有明显的差异。以上结果说明,大鼠与小鼠的红细胞嘌呤核苷磷酸化酶不是性质相同的酶。电离辐射可使大鼠酶反应的Q10与表观米氏常数增加,而对小鼠酶却无影响。前者反映酶的结构发生了变化,而后者的结构没有改变。

关键词：嘌呤核苷磷酸化酶米氏常数大鼠小鼠小家鼠酶活力酶活性红细胞红血球

枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶的纯化及酶学性质研究

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生物技术通讯 2008年第3期19卷 391-393页

作者：刘淑云赵希景谢希贤徐庆阳陈宁天津科技大学生物工程学院天津300457

目的:对枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶进行分离纯化及酶学性质研究。方法:经加热、硫酸铵盐析和SephadexG-100凝胶过滤,对枯草芽孢杆菌TM903中的嘌呤核苷磷酸化酶进行分离纯化,并对其酶学性质进行研究。结果:酶的最适反应温度为65... 详细信息

目的:对枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶进行分离纯化及酶学性质研究。方法:经加热、硫酸铵盐析和SephadexG-100凝胶过滤,对枯草芽孢杆菌TM903中的嘌呤核苷磷酸化酶进行分离纯化,并对其酶学性质进行研究。结果:酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值为7.5,在30～50℃时热稳定性较好;K+对该酶有激活作用,而Na+、Ca2+、Mg2+、Mn2+等金属离子对该酶有抑制作用;Km值为2.11mmol/L,Vmax值为0.84mmol/(min·L)。结论:分离纯化了枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶,并研究了其酶学性质,为利巴韦林的发酵工艺优化提供了重要的酶学理论基础。

关键词：枯草芽孢杆菌嘌呤核苷磷酸化酶分离纯化酶学性质

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶的特性及其在基因治疗中的应用

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实用癌症杂志 2008年第5期23卷 546-547页

作者：饶泽昌李文林石小玉南昌大学抚州医学分院 344000 江西省医学院 330006

自杀基因是一类前体药物转换酶基因,目前研究过的自杀基因有十余种,最常用的是HSV-TK/GCV[1]和CD/5-FC[2]2种自杀基因系统,对多种肿瘤具有治疗作用等.近来发现的大肠杆菌deoD基因编码的嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylas... 详细信息

自杀基因是一类前体药物转换酶基因,目前研究过的自杀基因有十余种,最常用的是HSV-TK/GCV[1]和CD/5-FC[2]2种自杀基因系统,对多种肿瘤具有治疗作用等.近来发现的大肠杆菌deoD基因编码的嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase,PNP酶),能催化前体药物--腺苷类似物产生毒性嘌呤,具有高效能、高旁观者效应和抗非增殖细胞活性的优点,成为目前自杀基因治疗中的热点.现就大肠杆菌PNP酶的特性、在基因治疗中的应用等做一综述.

关键词：嘌呤核苷磷酸化酶大肠杆菌基因治疗

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因系统的体外杀瘤研究

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中国肿瘤生物治疗杂志 2000年第4期7卷 302-303页

作者：谢庆军陆应麟李庶心刘爽王涛王志清军事医学科学院基础医学研究所北京100850 军事医学科学院放射医学研究所

在肿瘤自杀基因的研究中，基因转染效率低下以及旁杀伤效果差，是人们面临的两个主要难题。大肠杆菌DeoD基因产物(嘌呤核苷磷酸化酶PNP)与哺乳动物嘌呤核苷磷酸化酶的区别在于它们的底物专一性不同，它能催化几种无毒的脱氧腺苷类似物... 详细信息

在肿瘤自杀基因的研究中，基因转染效率低下以及旁杀伤效果差，是人们面临的两个主要难题。大肠杆菌DeoD基因产物(嘌呤核苷磷酸化酶PNP)与哺乳动物嘌呤核苷磷酸化酶的区别在于它们的底物专一性不同，它能催化几种无毒的脱氧腺苷类似物转化为剧毒的腺嘌呤类似物。研究发现[1]，用大肠杆菌PNP基因的真核表达载体转染人结肠癌细胞系，虽转染效率不到1％，当给予前体药6-甲基嘌呤-2＇-脱氧核糖核苷(6-MPDR，脱氧腺苷类似物，为大肠杆菌PNP的底物)后，则导致几乎所有周围细胞的死亡。这些结果表明，PNP／6-MPDR已经成为一个新型的自杀基因系统，而且它的旁杀伤作用是其它自杀基因系统无可比拟的，这就极大地弥补了转染率低下的不足。本文在构建了自杀基因载体pcDNA3-PNP的基础上[2]，进一步在体外证实了PNP／6-MPDR自杀基因系统的功能，为以后研究PNP／6-MPDR自杀基因系统在肿瘤基因治疗中的应用打下了基础。1 材料与方法1．1 材料1．1．1 菌株及质粒*** Top10；自杀基因载体pcD-NA3-PNP，本实验室构建[2]。

关键词：肿瘤基因治疗自杀基因嘌呤核苷磷酸化酶

合成利巴韦林的关键酶嘌呤核苷磷酸化酶的原核表达及活性分析

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生物技术通讯 2009年第4期20卷 530-533页

作者：邢晨光吴飞王光路谢希贤徐庆阳陈宁天津科技大学生物工程学院天津300457

目的:在枯草芽孢杆菌中表达嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)并分析其活性。方法:将PNPase的编码基因deoD克隆入pDG148表达载体,构建原核穿梭型表达载体pDG148-deoD,采用电转化方法将表达载体转入枯草芽孢杆菌WB600后诱导表达重组PNPase;研究重... 详细信息

目的:在枯草芽孢杆菌中表达嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)并分析其活性。方法:将PNPase的编码基因deoD克隆入pDG148表达载体,构建原核穿梭型表达载体pDG148-deoD,采用电转化方法将表达载体转入枯草芽孢杆菌WB600后诱导表达重组PNPase;研究重组PNPase的活性。结果与结论:获得的重组PNPase活性较对照提高了193.9%,其最适催化条件为65℃、pH7.5、500μmol/L底物浓度和1%1,2,4-三氮唑-3-羧甲酰胺;对重组菌的发酵条件进行了初步优化,IPTG诱导6h后在发酵液中添加0.5%的Tween-80能大幅度提高重组PNPase的酶活力。

关键词：嘌呤核苷磷酸化酶原核表达活性分析利巴韦林

relA基因在重组大肠杆菌BL21合成嘌呤核苷磷酸化酶作用研究

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工业微生物 2014年第3期44卷 30-34页

作者：段纪甫高黎荣李江付水林宫衡华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237

利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21中relA基因,获得△relA突变株。进一步研究表明在LB复合培养中relA基因对大肠杆菌的生长几乎没有明显影响,但是对其重组蛋白的合成有着较大的影响:降低了25%。结果表明,relA基因在大肠杆菌表达重组... 详细信息

利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21中relA基因,获得△relA突变株。进一步研究表明在LB复合培养中relA基因对大肠杆菌的生长几乎没有明显影响,但是对其重组蛋白的合成有着较大的影响:降低了25%。结果表明,relA基因在大肠杆菌表达重组蛋白方面有着较重要的作用。

关键词：大肠杆菌 Red重组 relA基因嘌呤核苷磷酸化酶

γ射线对红细胞嘌呤核苷磷酸化酶的影响一、酶活力的比较研究

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实验生物学报 1982年第1期 15-19页

作者：方允中刘智峰军事医学科学院放射医学研究所

用大鼠、小鼠及狗作为实验动物进行辐射对红细胞嘌呤核苷磷酸化酶活力影响的比较研究。在离体实验中,用9700或97000拉德照射大鼠及小鼠的肝素抗凝血,可观察到红细胞嘌呤核苷磷酸化酶活力轻微减低,而在整体实验中却得到以下的不同结果: 1... 详细信息

用大鼠、小鼠及狗作为实验动物进行辐射对红细胞嘌呤核苷磷酸化酶活力影响的比较研究。在离体实验中,用9700或97000拉德照射大鼠及小鼠的肝素抗凝血,可观察到红细胞嘌呤核苷磷酸化酶活力轻微减低,而在整体实验中却得到以下的不同结果: 1.用400、600及700拉德分别照射大鼠,均可使酶活力下降。400或600拉德照射后酶活力下降至一定时日可恢复至照射前水平,但700拉德照射后酶活力一直下降且始终未恢复。照射后大鼠酶活力的抑制与恢复程度与辐射损伤的轻重有关。2.以800、900和1000拉德的剂量分别照射小鼠后,酶活力无明显变化。经700或1200拉德照射后第1天,狗的红细胞嘌呤核苷磷酸化酶活力较照射前显著下降,而且以后各日,一直处于低的水平。

关键词：嘌呤核苷磷酸化酶小鼠比较研究小家鼠酶活性酶活力红血球红细胞

基于毛细管电泳在柱酶微反应器技术筛选嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂

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基于毛细管电泳在柱酶微反应器技术筛选嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂