检索结果-南通市图书馆

微生物学报 2014年第6期54卷 641-647页

作者：刘玥何菊华谢希贤徐庆阳张成林陈宁天津科技大学生物工程学院代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室天津300457

【目的】研究嘌呤操纵子中purF、purM、purN、purH和purD基因的共同过表达对枯草芽孢杆菌发酵生产腺苷的影响。【方法】利用温敏质粒pKS1,以单交换的形式增加了purF基因在基因组上的拷贝数,同时将强启动子P43插入嘌呤操纵子中,使嘌呤合... 详细信息

【目的】研究嘌呤操纵子中purF、purM、purN、purH和purD基因的共同过表达对枯草芽孢杆菌发酵生产腺苷的影响。【方法】利用温敏质粒pKS1,以单交换的形式增加了purF基因在基因组上的拷贝数,同时将强启动子P43插入嘌呤操纵子中,使嘌呤合成途径中purF基因及其下游purM、purN、purH和purD基因的表达水平得到加强,通过实时定量PCR(Realtime Quantitative PCR,RT-qPCR)测定相关基因(purF、purM、purN、purH和purD)的转录水平;通过酶活性检测分析关键酶基因扩增对PRPP转酰胺酶活性的影响;通过发酵实验考察出发菌株与工程菌株的生长、耗糖和腺苷积累情况。【结果】实时定量PCR结果表明,purF、purM、purN、purH和purD基因的表达水平均有不同程度的提高,嘌呤合成途径中关键酶PRPP转酰胺酶的活性是出发菌株的2.4倍。摇瓶发酵实验发现工程菌腺苷产量较出发菌提高17.5%,糖苷转化率增加26.1%。5 L罐发酵实验表明,虽然工程菌的菌体生长受到一定的影响,但在相同发酵周期内腺苷产量比出发菌提高了9.7%。【结论】嘌呤操纵子中purF、purM、purN、purH和purD基因转录水平的增强能够提高腺苷的产量,为通过代谢工程技术改造腺苷生产菌提供了理论依据和研究思路。

关键词：枯草芽孢杆菌腺苷 PRPP转酰胺酶启动子 purF 嘌呤合成途径

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产核黄素基因工程菌E. coli DR01的代谢工程改造

产核黄素基因工程菌E. coli DR01的代谢工程改造

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作者：刁娜天津大学

学位级别：硕士

本文以*** DR01为出发菌株,考察了从5-磷酸核糖到核黄素/FMN合成途径中的相关基因修饰对核黄素合成的影响,确定了效果显著的基因修饰靶标,并构建得到一系列核黄素产量显著提升的工程菌株。首先,基于中等拷贝数质粒载体（Col E1复制子）... 详细信息

本文以*** DR01为出发菌株,考察了从5-磷酸核糖到核黄素/FMN合成途径中的相关基因修饰对核黄素合成的影响,确定了效果显著的基因修饰靶标,并构建得到一系列核黄素产量显著提升的工程菌株。首先,基于中等拷贝数质粒载体（Col E1复制子）分别构建了嘌呤合成途径中两个关键基因prs和purF,以及从IMP到GTP合成途径中的四个基因guaA、guaB、ndk和gmk的表达质粒以强化其表达水平;基于sRNA技术分别构建了purA、guaC、ribF基因的sRNA表达质粒以下调其表达水平。将构建的质粒导入DR01菌株（其核黄素产量为473.5mg/L）并进行摇瓶发酵,各个基因修饰结果如下:rib F表达受到抑制的菌株DR11S的核黄素产量达到1173.4mg/L,比出发菌株DR01提高了147.8%,得率为112.8mg/g葡萄糖;prs过表达的菌株DR03的核黄素产量达到898.7mg/L,提高了89.8%,得率达到88.7mg/g葡萄糖;过表达pur F的菌株DR04的核黄素产量达到762.1mg/L,提高了61%,得率为75mg/g葡萄糖;过表达gua A的菌株DR05的核黄素产量达到748.7mg/L,提高了58.1%,得率为74.9mg/g葡萄糖,该菌株经过初始接种量优化后,核黄素产量进一步提升至991.6mg/L,得率为94.4mg/g葡萄糖;pur A表达受到抑制的菌株DR09的核黄素产量达到704mg/L,提高了48.7%,得率达到70.9mg/g葡萄糖,另外,过表达基因gua B,ndk分别能够使核黄素产量提高24.2%和30.3%,效果也比较显著。随后,对效果较好的基因修饰进行了不同的双基因修饰的组合,但同单基因修饰相比,核黄素的产量均没有得到进一步的提升,反而有不同程度的下降。我们发现采用中等拷贝数质粒进行多基因表达时会显著增加菌株的代谢负担和质粒丢失率,因此,考察了稳定性更好的低拷贝质粒（p SC101复制子）来表达基因prs,purF和guaA的效果,相应菌株的核黄素产量分别为616.4mg/L,620.5mg/L和725.6mg/L,比出发菌株提高了30.2%,31.1%和53.2%,该结果再次证明了这三个基因表达对提高核黄素合成的效果显著,虽然其产量比采用中等拷贝数质粒有所下降,但极大地降低了菌株的代谢负担,并且在单位时间内的核黄素产量均有所提升,表明可以基于该质粒进行多基因修饰的组装。本研究不仅得到核黄素产量和得率大幅度提升的工程菌株,还确定了对核黄素合成有重要影响的几个基因修饰靶标,为后续的多基因修饰组合和表达模块组装奠定了基础。

关键词：大肠杆菌核黄素 sRNA 嘌呤合成途径代谢工程

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