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作者：樊彦丽天津科技大学

学位级别：硕士

甘露聚糖是由β-1,4-糖苷键连接的甘露糖或者甘露糖和葡萄糖为骨架的一类多糖。对于半乳甘露聚糖与半乳葡甘露聚糖,其侧链可以被α-1,6-糖苷键连接的半乳糖残基取代。甘露聚糖的结构较为复杂因而降解过程需要多种糖苷水解酶共同完成。... 详细信息

甘露聚糖是由β-1,4-糖苷键连接的甘露糖或者甘露糖和葡萄糖为骨架的一类多糖。对于半乳甘露聚糖与半乳葡甘露聚糖,其侧链可以被α-1,6-糖苷键连接的半乳糖残基取代。甘露聚糖的结构较为复杂因而降解过程需要多种糖苷水解酶共同完成。嗜碱芽孢杆菌n16-5(Bacillus sp.n16-5)能够利用甘露聚糖作为碳源,快速生长。前期研究发现了该菌基因组上有一个长达17kb的基因簇,经序列预测该基因簇包含甘露聚糖降解酶manABCDEF,其中ManA已被表征为一个高活性β-1,4-甘露聚糖酶。本论文对该基因簇编码的ManB和ManC两个糖苷水解酶进行了研究。manB全长 942bp,编码 314 个氨基酸。ManB 与来源于Alicyclobacillus ciadocaldarius菌株的β-1,4-甘露聚糖酶的序列一致性达45%。序列一致性和保守催化区域表明ManB属于GH113的β-甘露聚糖酶。ManB对甘露寡糖显示出活性,并且能与ManA协同作用将甘露聚糖降解产生还原糖。ManB最适温度为30℃,最适pH为6.0。经测定ManB对甘露五糖的比活为6.98U/mg,Km值为0.54 mmol/L。manC全长1152bp,编码384个氨基酸。ManC与来自Bacteroides graminisolvens的一个α-半乳糖苷酶的一致性高达46%。序列分析表明ManC是一个属于GH27家族的α-半乳糖苷酶。ManC能够水解甘露聚糖产生半乳糖,同时对pnPGal有活性。以pnPGal为底物时测得ManC的最适温度为40℃,最适pH为5.0。通过计算得到ManC的比活力为1.08U/mg。对ManA、ManB与ManC联合降解甘露聚糖的研究结果表明,在ManA作用的基础上加入ManB与ManC能将甘露聚糖降解的更加充分,生成甘露糖和分子更小的甘露寡糖。当使用刺槐豆胶作为底物时,与单独添加ManA相比,当ManA和ManB 同时和依次添加时,还原糖的产量分别提高了 47.0%和51.7%,而当使用魔芋粉作为底物时,则分别提高了 44.0%和91.4%。

关键词：嗜碱芽孢杆菌n16-5 甘露聚糖 β-甘露糖苷酶 α-半乳糖苷酶

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来源于嗜碱芽孢杆菌n16-5甘露聚糖利用基因簇的乙酰酯酶AesA的克隆及性质分析

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中国生物工程杂志 2020年第3期40卷 65-71页

作者：马翠萍刘朵朵潘炳菊申会涛宋亚囝天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室暨天津市工业微生物重点实验室天津300457

天然来源的多糖底物上常存在乙酰基取代,特异性的乙酰酯酶能够切割这些底物上的乙酰基,从而有利于聚糖底物的进一步降解。对Bacillus sp.n16-5甘露聚糖利用基因簇上编码的乙酰酯酶AesA进行了基因克隆和异源表达,并对其酶学性质进行了研... 详细信息

天然来源的多糖底物上常存在乙酰基取代,特异性的乙酰酯酶能够切割这些底物上的乙酰基,从而有利于聚糖底物的进一步降解。对Bacillus sp.n16-5甘露聚糖利用基因簇上编码的乙酰酯酶AesA进行了基因克隆和异源表达,并对其酶学性质进行了研究。aesA基因长957bp,编码318个氨基酸,属于碳水化合物酯酶第7家族。AesA对4-甲基伞形酮乙酸酯(4-methylumbelliferyl-acetate)表现出较好的催化活性,金属离子Fe^3+、Fe^2+、Mn^2+及Cu^2+对AesA活性均有不同程度的促进作用。AesA与甘露聚糖酶ManA对乙酰化的甘露聚糖底物具有显著的协同作用。此项研究有助于理解嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.n16-5对甘露聚糖的水解机制,并且在甘露聚糖降解中具有潜在的应用前景。

关键词：嗜碱芽孢杆菌n16-5 乙酰酯酶酶学性质甘露聚糖

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调控蛋白ManR对嗜碱芽孢杆菌n16-5甘露聚糖利用相关基因的转录调控研究

调控蛋白ManR对嗜碱芽孢杆菌N16-5甘露聚糖利用相关基因的转录调...

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作者：刘梦亚天津科技大学

学位级别：硕士

嗜碱芽孢杆菌n16-5(Bacillus sp.n16-5)是一株从内蒙古乌都淖湖沉积物中分离得到的半纤维素降解菌,可以利用甘露聚糖等半纤维素快速生长。前期的转录组研究发现了该菌基因组上的甘露聚糖基因簇,通过序列预测发现该基因簇编码甘露聚糖降... 详细信息

嗜碱芽孢杆菌n16-5(Bacillus sp.n16-5)是一株从内蒙古乌都淖湖沉积物中分离得到的半纤维素降解菌,可以利用甘露聚糖等半纤维素快速生长。前期的转录组研究发现了该菌基因组上的甘露聚糖基因簇,通过序列预测发现该基因簇编码甘露聚糖降解酶ManABCDEF,转运蛋白ManHIJ,以及调控蛋白ManR。其中ManA和ManH已经被成功表征,分别是胞外内切β-1,4-甘露聚糖酶和甘露寡糖转运蛋白底物结合蛋白。本论文旨在研究调控蛋白ManR对甘露聚糖降解基因簇中各相关基因转录的影响,序列预测表明ManR为LacI家族调控蛋白。本实验首先探究了 n16-5野生型菌株和manR缺失菌株甘露聚糖基因簇上各相关基因(manABCJH)在不同底物条件下的转录水平,结果显示manR敲除株基因簇上各相关基因转录水平较野生菌株在木糖条件下显著上调,manB、manA、manC、manH、manl的转录水平分别是野生型的132倍、24倍、52倍、21倍和15倍。敲除株和野生株基因转录水平差异在甘露聚糖条件下不显著,推测是由于野生株虽然表达ManR蛋白,但以甘露聚糖为底物的情况下,蛋白可以与效应物结合从而解除抑制。以上结果说明ManR为负调控因子。本实验进而构建了 ManR回补菌株,经检测基因簇上相关基因的转录水平均有一定程度的回复。本论文同时研究了 ManR敲除株对嗜碱芽孢杆菌利用甘露聚糖能力的影响,发现敲除菌株在生长初期3-6h会出现还原糖积累的现象,而后期还原糖被快速利用与野生型趋于一致。这说明敲除菌株中胞外聚糖酶在初期就能够大量表达,降解聚糖产生还原糖。本研究同时发现菌株n16-5发酵液上清可以降解槐豆胶产生分子量不同的寡糖,而发酵液上清和菌体破碎液上清共同作用可以进一步降解底物产生小分子量甘露寡糖、甘露糖及半乳糖,被菌体代谢利用。本论文揭示了该菌株甘露聚糖利用的调控机制:甘露寡糖由胞外ManA降解甘露聚糖产生,并由甘露寡糖转运蛋白ManHIJ转运进胞内。寡糖作为效应物与抑制蛋白ManR结合解除对甘露聚糖利用基因簇的抑制。本论文围绕嗜碱芽孢杆菌n16-5甘露聚糖利用基因簇的调控机制进行研究,证实了 ManR是一个以甘露寡糖为效应物的负调控因子。该研究揭示了嗜碱芽孢杆菌n16-5甘露聚糖基因簇的调控方式,有助于我们理解细菌在多糖利用过程中的应答和调控机制。

关键词：嗜碱芽孢杆菌n16-5 甘露寡糖调控蛋白ManR 转录调控

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来源于嗜碱芽孢杆菌的新型β-甘露聚糖酶BaMan113A结构与功能的研究

来源于嗜碱芽孢杆菌的新型β-甘露聚糖酶BaMan113A结构与功能的研...

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作者：马翠萍天津科技大学

学位级别：硕士

GH113家族是一个较新的糖苷水解酶家族,其成员都为β-甘露聚糖酶,目前关于该家族酶的研究较少。本研究对来源于Bacillus sp.n16-5的GH113家族的β-甘露聚糖酶BaMan113A进行了性质表征和结构分析,并对底物识别和催化相关的关键氨基酸位... 详细信息

GH113家族是一个较新的糖苷水解酶家族,其成员都为β-甘露聚糖酶,目前关于该家族酶的研究较少。本研究对来源于Bacillus sp.n16-5的GH113家族的β-甘露聚糖酶BaMan113A进行了性质表征和结构分析,并对底物识别和催化相关的关键氨基酸位点进行了研究。BaMan113A与来源于Alicyclobacillus sp.A4的GH113家族甘露聚糖酶Man1 13A氨基酸一致性最高,为54.75%。BaMan113A对甘露寡糖表现出明显的活性,产物主要为甘露糖及甘露二糖,对甘露聚糖活性相对较弱。本研究对BaMan113A进行了结构分析,该蛋白晶体结构形成二聚体构型,通过五个化学键的作用进行稳定。结构在空间排列上呈现出典型的(β/α)8-TIM桶状结构,桶状结构上部的凹槽为活性中心位置,实验证明Glu142和Glu222为酸/碱催化位点和亲核催化位点。活性中心与糖环结合的-2位与W238存在π堆叠作用,W11与-2位糖环形成T堆叠作用以稳定与底物的结合。BaMan113A与GH113家族β-甘露聚糖AaManA表现出相似的三级结构,但活性口袋相对比较内敛,-2位与底物结合比AaManA少两个氢键,n236与W93在+2位不能形成糖-π三明治结构以稳定糖环。位于二聚体形成摆动较大的loop区的F101会对另一个单体的活性中心形成一定的空间位阻,从而影响水解的活性及方式。本研究对7个关键氨基酸位点进行了 20种单突变,发现F101E对槐豆胶的活性为原来的203.88%,对魔芋粉的活性是原来的198.1%。n236Y对槐豆胶的活性为原来的246.7%,对魔芋粉的活性是原来的234.1%,除n236及F101外其余位点的突变酶活力均下降。BaMan113A/F101E对聚糖底物的主要水解产物由甘露糖变为一系列的甘露寡糖,BaMan113A/n236Y对聚糖底物的主要水解产物中甘露寡糖的含量也大大提高。BaMan113A/F101E/n236的催化活力接近于两个单突变之和,对甘露聚糖的水解产物中甘露寡糖的含量比野生型及单突变都要高,甘露糖含量高于BaMan113A/F101E,但低于野生型及BaMan113A/n236Y。根据结构分析推测n236及F101位点影响了+2位氨基酸与底物的结合,从而使酶内切活性增强。本研究通过对BaMan113A进行结构和性质研究,明确了该酶的催化机制,通过对关键氨基酸位点的突变获得了对聚糖活性提高的突变体以及特异性发生改变的突变体。该研究有助于深化对113家族蛋白结构和功能的了解,同时可以为β-甘露聚糖酶的蛋白质工程改造提供新颖的见解。

关键词：嗜碱芽孢杆菌n16-5 β-甘露聚糖酶结构突变体

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