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嗜热蛋白酶PH1704别构中心量子化学计算与突变体动力学

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高等学校化学学报 2014年第1期35卷 146-153页

作者：詹冬玲高楠韩葳葳冯雁吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室长春130012 吉林农业大学食品科学与工程学院长春130118 中国科学院长春应用化学研究所长春130022

通过量子化学计算，确定嗜热菌PyrococcushorikoshiiOT3的PHl704蛋白酶别构位点的关键残基为Argll3，Tyrl20和Asnl29．其中，Argll3及Asnl29与别构抑制剂结合，参与别构调控．Tyrl20残基位于亚基交界面附近，并与亲核残基Cys100之间以... 详细信息

通过量子化学计算，确定嗜热菌PyrococcushorikoshiiOT3的PHl704蛋白酶别构位点的关键残基为Argll3，Tyrl20和Asnl29．其中，Argll3及Asnl29与别构抑制剂结合，参与别构调控．Tyrl20残基位于亚基交界面附近，并与亲核残基Cys100之间以氢键相连，可通过影响亚基聚合来影响酶的亲核催化．DJ-1超家族的4种构建蛋白的结构显示，120位点位于亚基交界面处，影响亚基的聚合，进而影响蛋白酶的活力，并间接参与别构调控．分子生物学实验显示，突变体R113T／Y120P／N129D的kcat/km（L·μmol^-1·min^-1）值是野生型kcat/km。值的6倍，h系数由野生型的0．86转变为1．3，负协同效应消失．113和129位点处阴离子别构剂脱离，从而破坏113，120和129位点间的封闭环结构，使AC交界面胡螺旋（124～129，524—529）间聚合度增强；120位点残基由rryr转变为Pro，与Cys100间氢键断裂，亲核进攻的阻力减小，从而使酶活力提高，别构负调控消失．

关键词：嗜热蛋白酶量子化学计算别构中心定点突变

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嗜热蛋白酶生产菌的筛选

西南师范大学学报（自然科学版） 2006年第2期31卷 157-161页

作者：张云峰淮阴师范学院生物学系江苏淮安223300

从温泉水、高温堆肥等样品中初筛到62株嗜热蛋白酶生产菌,进一步复筛出一株高产嗜热蛋白酶的生产菌株DPE7(菌株来自温泉水),该菌株被初步鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp．)．嗜热蛋白酶生产的最适碳源是葡萄糖, 最佳氮源为酵母粉加硫酸铵,C... 详细信息

从温泉水、高温堆肥等样品中初筛到62株嗜热蛋白酶生产菌,进一步复筛出一株高产嗜热蛋白酶的生产菌株DPE7(菌株来自温泉水),该菌株被初步鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp．)．嗜热蛋白酶生产的最适碳源是葡萄糖, 最佳氮源为酵母粉加硫酸铵,Ca2+对菌株产酶具有促进作用．在65℃、175 r／min、pH 9的产酶培养基中振荡培养 24 h后,发酵液中的酶产量高达23．4 U／mL(60℃测定)．

关键词：芽孢杆菌嗜热蛋白酶产酶条件

嗜热蛋白酶生产菌Bacillus ***7的筛选、产酶条件及其酶学性质研究

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作者：张云峰广西大学

学位级别：硕士

本研究从温泉水中筛选到一株产嗜热蛋白酶的芽孢杆菌(***)。该菌最适生长培养基为：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母浸出粉2g，NaCl3g，水1000ml，pH8.0;最适生长温度为65℃;最适生长转速为150rpm。最适产酶培养基为：(NH)S01g，酵母浸出粉1... 详细信息

本研究从温泉水中筛选到一株产嗜热蛋白酶的芽孢杆菌(***)。该菌最适生长培养基为：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母浸出粉2g，NaCl3g，水1000ml，pH8.0;最适生长温度为65℃;最适生长转速为150rpm。最适产酶培养基为：(NH)S01g，酵母浸出粉1g，葡萄糖1g，NaCl1g，MgSO0.5g，MnCl0.05g，干酪素0.1g，CaCl2g，水1000ml，pH9.0。Bacillus ***在此产酶培养基中振荡培养24h后，发酵液酶产量为23.4U／ml(60℃测定)。由Bacillus ***，产生的嗜热蛋白酶是一种胞外蛋白酶，其胞外蛋白酶的酶活占总酶活的90％以上。该酶最适作用pH为9.0;最适作用温度为85℃;80℃保温2h，酶活仍保持60％;90℃时酶活的半衰期为20min;在60℃时，pH稳定范围为6.0～11.0;在80℃时，pH稳定范围为6.0～10.0。Ca、有机溶剂能提高该酶的热稳定性。上述结果表明，由Bacillus ***，产生的蛋白酶是一个稳定性相对较好、最适作用pH谱相对较宽(6.0-10.0)的嗜热(最适作用温度为85℃)蛋白酶类。该菌是一株具有进一步遗传改造利用价值的产嗜热蛋白酶的菌株。

关键词：芽孢杆菌嗜热蛋白酶产酶条件酶的特性

嗜热蛋白酶WF146的C端与热稳定性相关性质的研究

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嗜热蛋白酶WF146的C端与热稳定性相关性质的研究

作者：王雅嗣武汉大学

学位级别：硕士

嗜热蛋白酶WF146是来源于嗜热菌Brev访acillus ***146的一种丝氨酸蛋白酶,它属于枯草杆菌蛋白酶家族(subtilisin family)。前期实验结果表明,在酶原的C端加上、缺失或者是改变氨基酸残基之后会对其成熟酶的热稳定性产生不利的影响。为... 详细信息

嗜热蛋白酶WF146是来源于嗜热菌Brev访acillus ***146的一种丝氨酸蛋白酶,它属于枯草杆菌蛋白酶家族(subtilisin family)。前期实验结果表明,在酶原的C端加上、缺失或者是改变氨基酸残基之后会对其成熟酶的热稳定性产生不利的影响。为了研究蛋白酶WF146的C端对其生化性质的作用,我们构建了一系列在C端后带有不同“尾巴”的突变体。结果表明,无论C端“尾巴”的长短和种类,多余的C端“尾巴”都会造成热稳定性的下降。我们可以知道蛋白酶WF146的C端对于其耐高温的性质有着不可取代的作用,C端结构的改变和破坏可能会影响酶分子的整体结构,使其变得相对松散,从而对性质产生影响。同时,我们还发现C端“尾巴”会导致酶原在加工成熟的过程中速度减慢,我们推测可能是因为加工成熟过程中,酶原既要切除N端前肽,又要切除C端“尾巴”,这两者呈竞争关系,从而影响加工成熟的速度。另外,我们根据实验室前期筛选出的一些突变位点,对C端带有Leu-Glu-His6的蛋白酶WF146,即WF146-X-H,进行组合突变。在构建出的39个突变体中,有许多突变体的催化活性或者(和)热稳定性都要高于野生型和亲本型,如SH47、SH48、SH50、SH51和SH55等,这说明利用累加效应可以得到比天然酶性质更好的重组酶。我们还初步探究了嗜热蛋白酶WF146及其本实验室前期获得的突变体酶N63P/A66P和PBL5对角蛋白的降解能力,并与商品化的蛋白酶K的降解能力进行了比较。我们发现在50℃时,蛋白酶K对角蛋白的降解效果最好,WF146及其突变体的降解效果相互之间没有很大的差异;在80℃时,蛋白酶K很快失活,而嗜热酶N63P/A66P和PBL5仍然能够继续降解角蛋白,N63P/A66P处理角蛋白8h后就基本将其降解完全。另外,我们发现尽管突变体N63P/A66P的催化活性和热稳定性不如PBL5,但是其对角蛋白的降解能力却要高于后者,我们推测可能是该突变位点改变了酶对底物的特异性。我们将这个位点组合进PBL5中,构建出了 PBL5N,PBL5N在80℃的稳定性和PBL5相差无几,但是对角蛋白的降解能力要优于PBL5,和N63P/A66P相当,在处理角蛋白8h后,能够基本将其降解完全。本研究通过对嗜热蛋白酶WF146的C端与热稳定性相关性质进行了探究与分析,为嗜热酶的定向进化和工业应用提供了思路。

关键词：嗜热蛋白酶 C端热稳定性降解角蛋白

嗜热蛋白酶生产菌Bacillus ***_7的产酶条件研究

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广西大学学报（自然科学版） 2004年第3期29卷 231-235页

作者：张云峰李有志莫天砚淮阴师范学院生物学系江苏淮安223001 广西大学分子遗传研究所广西南宁530005 广西大学农学院广西南宁530005

芽孢杆菌(Bacillussp.)DPE7产嗜热蛋白酶的适宜条件,较好的碳源是0.1%葡萄糖,最佳氮源为酵母粉加硫酸铵,在pH6～11范围内产酶均良好.在65℃,175r/min,pH9的产酶培养基中发酵24h,产酶量可达23.4U/mL.0.01%MnCl2,0.15%CaCl2或0.15%吐温存... 详细信息

关键词：芽孢杆菌嗜热蛋白酶产酶条件

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嗜热蛋白酶的研究与应用

淮阴师范学院学报（自然科学版） 2003年第3期2卷 245-249页

作者：张云峰罗玉明王新风淮阴师范学院生物系江苏淮安223001

介绍了国内外关于嗜热蛋白酶的研究成果与应用现状.包括产生嗜热蛋白酶的微生物种类,嗜热蛋白酶的特点、稳定机制及基因的克隆策略,嗜热蛋白酶的生产、提取、纯化以及应用.

关键词：嗜热蛋白酶嗜热微生物稳定机制

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嗜热蛋白酶WF146的成熟冷适应研究

嗜热蛋白酶WF146的成熟冷适应研究

“环境与健康”学术研讨会

作者：杨怡然唐兵武汉大学生命科学学院

嗜热蛋白酶 WF146是一种最适温度为85℃的丝氨酸蛋白酶,己在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功表达及纯化。表达产物以可溶的无活性酶原形式存在,经过在60℃加热处理后,能在 N 端前肽协助下进行正确折叠、自加工,最终切除 N 端前肽转变为有活性... 详细信息

嗜热蛋白酶 WF146是一种最适温度为85℃的丝氨酸蛋白酶,己在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功表达及纯化。表达产物以可溶的无活性酶原形式存在,经过在60℃加热处理后,能在 N 端前肽协助下进行正确折叠、自加工,最终切除 N 端前肽转变为有活性的成熟酶,而在低温下酶原成熟过程缓慢。嗜冷酶 S41与 WF146蛋白酶具有67.1%的序列同一性。通过对 S41的 X 衍射晶体三维结构分析比对,确定其底物结合区附近序列,并分为两个区域利用定点突变的方法与 WF146蛋白酶相应区域进行置换。引入嗜冷酶 S41底物结合区附近序列后,使 WF146蛋白酶酶原在较低温度下成熟速度明显增加。与突变前相比,含两个区域共七个氨基酸替换(S105G/G107D/Y117E/S136N/V143G/K144E/D145S)的突变体酶原在室温(25℃)下转变为成熟酶,并完全释放活性比野生型提前约10小时。比较野生型和突变体 WF146成熟酶热动力学参数 K、K和 k/K,还发现受底物结合区改变影响,自加工过程明显变快的突变体同时表现出改变的底物专一性。对大分子底物 casein 和蛋白质 BSA 的降解对比也与上述结果一致。通过研究来源于极端环境微生物的蛋白酶结构和功能,探索酶温度适应机制具有重要理论意义和应用价值。作为主要生物功能大分子,蛋白酶通常以酶原形式存在,不同条件下酶原折叠加工成熟与其功能和调控联系紧密。本研究模拟嗜冷酶 S41底物结合区附近序列,使嗜热蛋白酶 WF146在低温下自加工过程加快, 出现酶原成熟冷适应的现象。证明底物结合区的改变对 WF146蛋白酶成熟过程中前肽的自加工和释放有明显影响,提示前肽和底物结合区的相互作用对蛋白酶原的成熟有关键作用。

关键词：嗜热蛋白酶 WF146 酶原成熟冷适应底物结合区

来源： cnki会议评论

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芽孢杆菌嗜热蛋白酶的性质研究

淮阴师范学院学报（自然科学版） 2004年第3期3卷 250-254页

作者：张云峰淮阴师范学院生物系江苏淮安223300

对芽孢杆菌嗜热蛋白酶的性质进行了研究.该酶的分子量为32kD,最适作用pH为9 0,最适作用温度为85℃,具有良好的pH稳定性(在60℃时,pH稳定范围为6 0～11 0;在80℃时,pH稳定范围为6 0～10 0)和热稳定性(90℃时酶活的半衰期为20min).钙离子... 详细信息

对芽孢杆菌嗜热蛋白酶的性质进行了研究.该酶的分子量为32kD,最适作用pH为9 0,最适作用温度为85℃,具有良好的pH稳定性(在60℃时,pH稳定范围为6 0～11 0;在80℃时,pH稳定范围为6 0～10 0)和热稳定性(90℃时酶活的半衰期为20min).钙离子和有机溶剂能提高该酶的热稳定性,而EDTA和PMSF则能抑制该酶活性.

关键词：芽孢杆菌嗜热蛋白酶嗜热性

嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3蛋白酶基因的原核表达、纯化和性质表征

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吉林大学学报（理学版） 2010年第6期48卷 1065-1069页

作者：詹冬玲白挨玺白鹤韩葳葳冯雁吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室长春130012 吉林农业大学食品科学与工程学院长春130118

将来源于嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3的蛋白酶(PH1704)基因在大肠杆菌BLP-CodonPlus中高效表达.采用超声、热失活和HiTrap Q Sepharose柱层析等方法对产物进行分离纯化.通过SDS-PAGE,Native-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定,发现该重组酶以十二聚体为主的寡聚体形式存在,并具有SDS抗性.蛋白酶活力染色表明,其六聚体以上有活力.以azo-gelation为底物,对其酶学性质进行初步研究表明,其最适温度为85℃,最适pH=8.0,并且具有良好的热稳定性.

关键词：嗜热蛋白酶表达纯化性质