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嗜热蓝细菌CO2浓缩机制的比较基因组学研究和BicA基因的表达

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嗜热蓝细菌CO2浓缩机制的比较基因组学研究和BicA基因的表达

作者：周慧珍成都大学

学位级别：硕士

光合作用是农作物产量形成的重要基础之一,作物利用光合作用从大气中吸收和转化无机碳元素,从而形成有机物。在农业生产中,改良作物的光合效率是提高作物产量的一个重要途径。但是目前作物光合过程中的CO固定酶Rubisco的催化反应受胞内... 详细信息

光合作用是农作物产量形成的重要基础之一,作物利用光合作用从大气中吸收和转化无机碳元素,从而形成有机物。在农业生产中,改良作物的光合效率是提高作物产量的一个重要途径。但是目前作物光合过程中的CO固定酶Rubisco的催化反应受胞内较低的CO浓度限制,阻碍了作物进行高效光合作用。研究发现蓝藻内部存在一种CO浓缩机制（CO-Concentrating Mechanism,CCM）,可以将CO在Rubisco活性位点周围浓缩,使其胞内浓度可以达到外界的1000倍以上。此外,在当今全球变暖的大背景下,对作物适应热环境又提出了新挑战。而嗜热蓝细菌既可在高温环境下正常生长,还可以维持高效的CO固定。因此,本研究以17株嗜热蓝细菌为研究对象,系统调查了它们的CCM组成、基因遗传多样性以及其基因组的分布和调控。此外,我们还克隆了6株嗜热蓝细菌CCM系统中的BicA基因,该基因在CCM系统中是组成型表达基因。利用构建的过表达载体,我们成功将BicA基因在模式菌株Synchechococcus *** 7942（PCC 7942）进行了表达,并评价了转化子表型和测定了生理生化指标。本文的主要研究结果如下:1、基于17株嗜热蓝细菌基因组序列的分析表明,CCM的Ci吸收系统在菌株间均存在差异。Ci吸收系统中,CO吸收系统（NDH-I和NDH-I）和HCO转运系统BicA均存在于所有17株嗜热蓝细菌中,而大多数菌株不具有Na依赖性的HCO转运系统Sbt,另一个HCO转运系统BCT1只在四个菌株中缺失。因此,可将这17株嗜热蓝细菌分为三种基因型:（I）包含NDH-I、NDH-I、BicA、sbt和BCT1的菌株;（II）NDH-I、NDH-I、BicA和sbt;以及（III）NDH-I、NDH-I、BicA和BCT1。此外,嗜热蓝细菌Ci吸收系统的大部分基因序列与模式菌株Synechocystis *** 6803的基因相似度较低,且系统发育分析结果显示嗜热蓝细菌的Ci吸收系统基因与嗜中温蓝细菌的Ci吸收系统基因存在较大的遗传差异。2、CCM的羧酶体系统在菌株间存在较大差异。通常β-蓝细菌基因组中包含ccm K1-4四种编码羧酶体壳蛋白基因,而本研究中的17株嗜热蓝细菌中只有3株的基因组拥有这样ccm K多样性。ccm K2在Thermoleptolyngbya菌株中缺失,而ccm K3/K4在所有Thermostichus和Thermosynechococcus菌株中都缺失。此外,羧基体β-CA、cca A在所有Thermosticus和Thermosynechoccus菌株都缺乏,而进一步的结构域分析发现,这些菌株虽然缺失cca A基因,但壳蛋白ccm M蛋白很可能替代其行使碳酸酐酶活性。此外,序列比对和系统发育分析结果明显,嗜热蓝细菌的羧酶体系统中的绝大多数基因与嗜中温蓝细菌的羧酶体系统基因存在较大的遗传差异。3、CCM相关基因在基因组中的位置分析表明,基因的分布在嗜热蓝细菌存在一定的差异,但也有相似之处。例如,除了Thermosynechococcus TA-1的ndh D4外,编码NDH-I复合体的三个基因都是成簇分布;羧酶体的基因也成簇分布,主要结构为ccm K1/2（1、2或者共有）-ccm L-ccm M-ccm N-ccm O（ccm O存在于11个基因组中）;编码Rubisco的rbc L、rbc S和rbc X也是成簇分布。CCM相关基因在基因组中的分布结果表明,成簇分布的基因很可能存在共调控现象,而其他零散分布的基因,可增加它们单独表达调控的灵活性,如应对外界环境的变化。4、在模式蓝细菌PCC 7942在成功构建过表达载体,并将来源于6株不同的嗜热蓝细菌的碳酸氢根转运基因BicA在PCC 7942进行了遗传转化,最终得到7株重组蓝细菌,传代培养结果表明表达质粒可稳定遗传,且形态学分析表明遗传转化对菌株的形态无明显影响。5、与无外源碳源对照组相比,有外源Na HCO实验组的生长速率更快,表明碳源的加入可促进菌株的生长;7株重组菌株在有外界碳源加入的环境下生物质积累量明显高于野生型菌株,表明转入的BicA基因可能加速了重组菌株对溶液中HCO离子的摄取,从而导致更多的碳源被固定进而转化为生物质。6、对捕光色素的研究表明,加入外源碳源后,野生型和重组菌株的叶绿素含量都出现增加,而类胡萝卜素则在野生型和三个重组菌株中减少,在其他重组菌株无明显变化。结果表明,叶绿素很可能在碳利用方面发挥主要作用,以吸收更多光能为提供CO化学能。而重组菌株中,A183＿bic A2的叶绿素含量增加了1.3倍,其生物质的积累在所有实验组也是最高的,表明该BicA基因可能转运HCO离子的效率更高,因此需要更多捕光色素来为CO固定提

关键词：嗜热蓝细菌光合作用二氧化碳浓缩机制(CCM) Rubisco 异源表达 BicA C3作物

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嗜热蓝细菌藻红蛋白的积累特征及稳定性研究

嗜热蓝细菌藻红蛋白的积累特征及稳定性研究

作者：姚丹成都大学

学位级别：硕士

早在上世纪70年代,天然色素便已进入了人们的生活。藻红蛋白作为一种粉色天然色素,存在于红藻、隐藻和蓝细菌中。由于藻红蛋白颜色鲜亮,且具有抗炎、抗氧化和清除自由基等功能,使其在食品、保健品、医药、化妆品、生物试剂等领域具有良... 详细信息

早在上世纪70年代,天然色素便已进入了人们的生活。藻红蛋白作为一种粉色天然色素,存在于红藻、隐藻和蓝细菌中。由于藻红蛋白颜色鲜亮,且具有抗炎、抗氧化和清除自由基等功能,使其在食品、保健品、医药、化妆品、生物试剂等领域具有良好的应用前景。但由于普通菌株所得藻红蛋白热稳定性和光稳定性不佳,易褪色变色,使其应用受到一定限制。本课题研究对象为川西甘孜地区温泉地带采集的嗜热蓝细菌,是一类生活在极端热环境的光合原核生物,其生长环境很可能赋予了其藻红蛋白更优的热稳定性等特质,从而为拓展藻红蛋白来源和应用提供新的思路。此外,研究表明光照条件对蓝细菌的色素积累有明显影响。因此,本课题探究了不同的光周期、光照强度和光色对三株嗜热蓝细菌的藻红蛋白积累的影响,同时测试了不同藻红蛋白提纯方法对其产量及纯度的影响。此外,对嗜热蓝细菌的藻红蛋白在不同温度、pH值、光照、贮存和食品添加剂下的稳定性进行了鉴定,为应用于食品添加提供了实验基础和技术储备。本文通过对菌株的筛选,获取了8株嗜热蓝细菌,并针对三个代表性菌株(E412、B334和B212)进行了详细鉴定。通过形态学和分子生物学鉴定(基于16S r RNA基因序列的系统发育分析)B212、B334和E412为Stanieria cyanosphaera B212、Leptothermofonsia sichuanensis B334和Leptothermofonsia sichuanensis E412。嗜热蓝细菌合成藻红蛋白的光适应性研究表明光照强度为600 Lx和以有周期变化的光照如16 h光照/8 h黑暗和12 h光照/12 h黑暗培养嗜热蓝细菌更有利于其藻红蛋白的积累,波长为454 nm(蓝光)和511 nm(绿光)的光照相对普通白炽灯对嗜热蓝细菌藻红蛋白的积累有促进作用,在波长为654 nm(红光)时对其积累有抑制效果。实验结果表明嗜热蓝细菌E412在光照周期为16 h光照/8 h黑暗,强度为600 Lx,波长为454nm(蓝光)的光照条件下达到藻红蛋白的最大积累量,使嗜热蓝细菌藻红蛋白粗提量达到21.92 mg/g DCW。稳定性研究结果表明,嗜热蓝细菌藻红蛋白处于60℃和pH在4-7之间的环境时能保持其良好的稳定性;可在4℃及以下的低温条件下长期保存;对在光照尤其是紫外光下表现出色的耐光能力,但强度极高的室外日光不利于保持其生理活性;适当浓度的山梨酸钾、蔗糖和氯化钠都有利于嗜热蓝细菌的藻红蛋白的保存和护色,经不同温度、pH值、光照、贮存条件和食品添加剂处理下皆显示其出众的稳定性。经蛋白结构同源建模发现,嗜热蓝细菌E412藻红蛋白相较两株海洋蓝细菌在6个位置上发生了氨基酸残基替换,可能是使E412藻红蛋白更稳定的机制。本课题中三种嗜热菌株藻红蛋白较其他中低温藻的藻红蛋白具有更优的稳定性,在高温、酸性环境和紫外灯照射下相对中低温菌株藻红蛋白有较好的耐受性,且其藻红蛋白置于低温贮存或加入山梨酸钾、蔗糖和氯化钠时更稳定。提取纯化工艺的结果表明,二次冻融和超声破碎能增大嗜热蓝细菌的藻红蛋白提取量,嗜热蓝细菌藻红蛋白盐析以饱和度为25%的硫酸铵为宜,且分级盐析较一级盐析能显著提升纯化效果。嗜热蓝细菌E412经冷冻干燥、研钵研磨、磷酸缓冲液溶胀、二次冻融和超声破碎,最终提取藻红蛋白23.24 mg/g DCW,较粗提法提高了30%;采用饱和度为25%硫酸铵分级盐析,最终藻红蛋白纯度为2.68,其纯度超过食品级接近药品级。通过SDS-PAGE分析纯化产物发现嗜热蓝细菌E412藻红蛋白含有α、β和γ三个亚基,分子量均在10-25 kDa之间。研究发现光周期、光照强度和光色对三株嗜热蓝细菌的藻红蛋白积累均有不同程度的影响;从温度、pH值、光照、贮存条件和食品添加剂角度下分析得知嗜热蓝细菌的藻红蛋白相对中低温菌株更稳定;对比藻红蛋白提纯方法,二次冻融、超声破碎、硫酸铵分级盐析可提升其提纯质量,在保证嗜热蓝细菌有较高水平的藻红蛋白积累的同时,还以经济高效的方法获得了纯度较高且稳定性好的藻红蛋白。为嗜热蓝细菌资源的开发奠定基础,也为嗜热蓝细菌藻红蛋白的后续利用和工业化生产提供了相应的依据和数据基础。

关键词：嗜热蓝细菌藻红蛋白光照条件分离纯化稳定性

嗜热蓝细菌碳酸酐酶基因的异源表达及酶学性质

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微生物学通报 2020年第2期47卷 450-458页

作者：侯娟李俐珩张海若李玫锦陈鹏宇 Maurycy Daroch 北京大学深圳研究生院环境与能源学院广东深圳518055

【背景】碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CAH)因其高效催化CO2转化为HCO3–的能力成为当今碳减排工艺中的研究热点,但因工厂烟道气的温度较高,因此寻求热稳定性高的嗜热碳酸酐酶是碳酸酐酶仿生学固碳的关键所在。【目的】克隆嗜热蓝细菌Th... 详细信息

【背景】碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CAH)因其高效催化CO2转化为HCO3–的能力成为当今碳减排工艺中的研究热点,但因工厂烟道气的温度较高,因此寻求热稳定性高的嗜热碳酸酐酶是碳酸酐酶仿生学固碳的关键所在。【目的】克隆嗜热蓝细菌Thermosynechococcuselongatus PKUAC-SCTE542和SynechococcuslividusPCC6715的碳酸酐酶基因Ecah、Pcah,实现其在大肠杆菌细胞中异源高效表达,并进行初步酶学性质研究。【方法】利用PCR技术获得碳酸酐酶基因cah,构建重组基因工程菌BL21_pETM11_CAH,利用IPTG诱导方法高效表达蛋白,表达产物(CAH)经Ni-Agarose亲和层析柱纯化后,进行酶学性质研究。【结果】从E542、PCC6715中克隆得到大小均为534 bp的碳酸酐酶基因,以CO2为底物,酶催化CO2水合的活性分别为42.6 WAU/mg-protein、47.6 WAU/mg-protein。碳酸酐酶ECAH 50°C处理30 min后,酶活提高了8%,而PCAH却下降了10%。Zn2+、磺胺对两种碳酸酐酶有显著抑制作用,Ca2+对ECAH有轻微激活作用,对PCAH无显著抑制作用。【结论】E542嗜热蓝细菌表达的碳酸酐酶比PCC6715的热稳定性强,符合处理工业高温点源烟道气的CO2的基本要求,丰富了碳减排的嗜热碳酸酐酶基因库。

关键词：嗜热蓝细菌嗜热碳酸酐酶异源表达

两株采自惠州的细鞘丝藻亚科(Leptolyngbyaceae)嗜热蓝细菌的分离鉴定及细胞组分分析

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微生物学通报 2019年第3期46卷 481-493页

作者：张艳婷江东唐杰雒义凡梁园梅 MD Mahfuzur R.Shah 金鹏 Maurycy Daroch 北京大学深圳研究生院广东深圳518055 成都大学药学与生物工程学院四川成都610106

【背景】随着CO_2排放增加,全球变暖愈发严峻,嗜热蓝细菌作为能够在45°C及以上环境中生长并实现生物固碳的微生物,具有重要的研究意义。【目的】对从广东惠州地区采集的藻种进行分离鉴定,并筛选出2株嗜热蓝细菌,研究其生长特性,为嗜热... 详细信息

【背景】随着CO_2排放增加,全球变暖愈发严峻,嗜热蓝细菌作为能够在45°C及以上环境中生长并实现生物固碳的微生物,具有重要的研究意义。【目的】对从广东惠州地区采集的藻种进行分离鉴定,并筛选出2株嗜热蓝细菌,研究其生长特性,为嗜热蓝细菌的后续应用提供依据。【方法】通过16SrRNA基因、藻蓝蛋白链A基因(PhycoA)序列分析确定从惠州地区采集到的菌株的分类学位置。对PKUAC-GDTS1-24和PKUAC-GDTS1-29两株嗜热蓝细菌进行形态观察和主要细胞成分(灰分、糖类、脂质、蛋白质和色素)分析。【结果】共分离出12株嗜热蓝细菌,其中PKUAC-GDTS1-24和PKUAC-GDTS1-29菌株,形态上呈蓝绿色球形毛状体,是由细胞形成密集的簇,彼此附着形成的。两株嗜热蓝细菌的主要细胞成分是糖类,分别占细胞干重的36.42%和28.46%。PKUAC-GDTS1-24的灰分、脂质和蛋白质含量分别为24.41%、21.40%和26.64%。PKUAC-GDTS1-29的细胞中,灰分、脂质和蛋白质含量分别为24.72%、23.92%和12.93%。藻蓝蛋白(Phycocyanin,PC)在PKUAC-GDTS1-24和PKUAC-GDTS1-29中的含量分别为157.29 mg/g DW和374.86 mg/g DW,类胡萝卜素分别为65.13 mg/g DW和18.87 mg/g DW。【结论】基于系统发育树研究,本实验的2个分离株属于细鞘丝藻亚科(Leptolyngbyaceae),与研究较少的纤发鞘丝蓝细菌属(Leptolyngbya)菌株相近,可能是广东和四川温泉中存在的一种新型丝状轻度嗜热蓝细菌属或Leptolyngbya新种。嗜热菌株PKUAC-GDTS1-24和PKUAC-GDTS1-29的形态和细胞组成相似,通过比较,2个菌株的藻胆蛋白含量远远高于其他研究报道的Leptolyngbya蓝细菌,尤其是PKUAC-GDTS1-29可以作为藻蓝蛋白生产的潜在菌株。

关键词：嗜热蓝细菌纤发鞘丝蓝细菌属(Leptolyngbya) 鉴定细胞组分

嗜热蓝细菌PKUAC-E542藻蓝蛋白耐热性以及不同光照条件对其含量影响研究

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北京大学学报（自然科学版） 2021年第3期57卷 529-535页

作者：李俐珩梁园梅李玫锦陈鹏宇肖萌崔逸璇 Maurycy Daroch 北京大学深圳研究生院环境与能源学院深圳518055

对PKUAC-SCTE542藻蓝蛋白的耐热性进行测试,探究其热稳定性能。同时,在不同光周期和不同光质光源组合条件下培养嗜热蓝细菌PKUAC-SCTE542,研究其生长情况和藻蓝蛋白含量,探索适用于藻蓝蛋白生产的光照条件。选取30℃,40℃,50℃,60℃,65... 详细信息

对PKUAC-SCTE542藻蓝蛋白的耐热性进行测试,探究其热稳定性能。同时,在不同光周期和不同光质光源组合条件下培养嗜热蓝细菌PKUAC-SCTE542,研究其生长情况和藻蓝蛋白含量,探索适用于藻蓝蛋白生产的光照条件。选取30℃,40℃,50℃,60℃,65℃,70℃,80℃,90℃为实验组,25℃和4℃为对照组,放置时间设为5小时和14天,用紫外分光光度计测定藻蓝蛋白全光谱图,考察不同温度和放置时间对藻蓝蛋白的影响,再将E542-PC的α链和β链与蛋白质晶体结构数据库中藻蓝蛋白进行比对,深入了解其耐热机制。分别在光波长为白光(400~800 nm)、红光(654 nm)、绿光(511 nm)和蓝光(454 nm),光周期为8L/16D,12L/12D和16L/8D的条件下培养蓝细菌,测定其生物质干重以及藻蓝蛋白含量。结果表明,PKUAC-SCTE542藻蓝蛋白在65℃环境可以保持稳定,60℃放置14天仍表现出60%的热稳定性。光质为红光、光周期为16L/8D的条件下,藻蓝蛋白绝对产量最大;光质为红光、光周期为8L/16D时,藻蓝蛋白产率最高。实验结果表明PKUAC-SCTE542藻蓝蛋白的耐热性能较好,经过光照条件筛选,藻蓝蛋白产量可提高近100 mg/gDCW。

关键词：嗜热蓝细菌藻蓝蛋白热稳定性光照条件

不同培养条件对嗜热蓝细菌生长及活性物质的影响研究

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可再生能源 2020年第1期38卷 1-7页

作者：雒义凡李俐珩李玫锦梁园梅 Maurycy Daroch 北京大学深圳研究生院环境与能源学院

为了探究嗜热蓝细菌的生长特性,文章设置了不同的温度和NaHCO3浓度,研究不同条件对分离所得的两株嗜热蓝细菌Thermosynechococcus elongatus PKUAC-SCT E111和Thermosynechococcus elongatus PKUAC-SCT E732的生长以及活性物质积累的影响,从而预估其固定烟道气中的CO2的潜力。研究结果表明:在一定温度范围内,嗜热蓝细菌的生长速率随着温度的升高而加快;二者均可在高温环境下生长,最佳生长温度均为50℃,其中,Thermosynechococcus elongatus PKUAC-SCT E732可在温度为60℃的条件下缓慢生长;适宜的NaHCO3浓度会促进两株蓝细菌的生长,当NaHCO3的浓度为0.1 mol/L时,两株蓝细菌的生长情况最佳,当NaHCO3的浓度为0.3,0.5 mol/L时,两株蓝细菌能够正常生长,当NaHCO3的浓度达到1 mol/L时,两株蓝细菌均无法存活;提升温度和NaHCO3浓度,能够促进蓝细菌内活性物质的积累,从而增加藻胆蛋白的合成量,改变脂肪酸的组成。

关键词：嗜热蓝细菌温度 NaHCO3 藻胆蛋白脂肪酸

不同光质对嗜热蓝细菌Synechococcus ***6715生长的影响

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北京大学学报（自然科学版） 2020年第4期56卷 739-744页

作者：李凯宫一玮李兴康张艳婷 Maurycy Daroch 金鹏北京大学深圳研究生院环境与能源学院深圳518055

使用光合有效光量子数密度(PAR)均为100μmol/(m^2·s)的白光(对照)、红光和蓝光,对对数生长期的嗜热蓝细菌PCC6715进行培养,以期探明不同光质对不表达藻红素的蓝细菌光适应生长的影响。结果表明,在不同光质培养对数生长期PCC6715的过程... 详细信息

使用光合有效光量子数密度(PAR)均为100μmol/(m^2·s)的白光(对照)、红光和蓝光,对对数生长期的嗜热蓝细菌PCC6715进行培养,以期探明不同光质对不表达藻红素的蓝细菌光适应生长的影响。结果表明,在不同光质培养对数生长期PCC6715的过程中,与白光相比,干重在蓝光下明显增加,红光下明显减少;红、蓝光质对光合色素合成产生影响的开始时间和持续时间有所不同;最大光能转化效率(Fv/Fm)在蓝光下明显提高,红光下明显降低,培养6天后,红、蓝光条件下的Fv/Fm均趋于稳定。蓝光有利于PCC6715的生长,红光不利于PCC6715的生长;同时,PCC6715在红、蓝光质中均产生适应性生长,藻蓝素的减少使PCC6715在红光中发生适应性生长,蓝光中PCC6715发生适应性生长是由于藻蓝素的增加。

关键词：蓝细菌嗜热蓝细菌光质光适应生长藻蓝素

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一株分离自四川温泉的嗜热鞘丝藻新种鉴定

北京大学学报（自然科学版） 2022年第4期58卷 739-752页

作者：李玫锦唐杰 Md.Mahfuzur R.Shah Maurycy Daroch 北京大学深圳研究生院环境与能源学院深圳518055 成都大学食品与生物工程学院成都610106

为了确定分离自四川甘孜地区温泉的嗜热丝状菌株B121的分类信息,为探索其应用价值提供遗传学分析基础,对其进行基因组分析、系统发育分析、二级结构预测、形态学鉴定以及结合菌株钠盐耐受性和固氮能力的整体分析。在16S rRNA的系统发育... 详细信息

为了确定分离自四川甘孜地区温泉的嗜热丝状菌株B121的分类信息,为探索其应用价值提供遗传学分析基础,对其进行基因组分析、系统发育分析、二级结构预测、形态学鉴定以及结合菌株钠盐耐受性和固氮能力的整体分析。在16S rRNA的系统发育分析中,发现菌株B121与菌株Thermoleptolyngbya oregonensis PCC 8501,Thermoleptolyngbya albertanoae ETS-08和Thermoleptolyngbya sp.O-77等嗜热鞘丝藻属菌株有较好的聚类。在16S-23S ITS二级结构预测分析中,菌株B121的D1-D1'区域与属内参考菌株有一定的相似性,序列同一性也较高,但都没有到达广义的同种物种标准,并且V2,BoxB及V3区域与其他对照菌株的差异较大。结合形态学分析,确定菌株B121是Thermoleptolyngbya属下的一个新种。菌株B121可在最高浓度为0.5 M的NaCl和NaNO_(3)培养基中生存,也可在浓度为1 M的NaCl培养基中存活。当气相条件为Ar:N_(2):CO_(2)=79:20:1(体积比)时,菌株B121的乙炔还原速率可以达到2564.1 nmol/(g·h)。

关键词：嗜热蓝细菌 16S rRNA 16S-23S ITS 系统发育分析二级结构