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加拿大将嗜热菌蛋白酶的使用范围扩大到面包、面粉等

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食品与生物技术学报 2022年第5期41卷 65-65页

2022年3月24日,加拿大卫生部发布NOM/ADM-0181号文件,将蛋白酶热解蛋白无氧芽孢杆菌TP7(Anoxybacillus caldiproteolyticus TP7)生产的嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)的使用范围扩大到面包、面粉、全麦面粉和非标准烘焙产品,同时修订允许的... 详细信息

2022年3月24日,加拿大卫生部发布NOM/ADM-0181号文件,将蛋白酶热解蛋白无氧芽孢杆菌TP7(Anoxybacillus caldiproteolyticus TP7)生产的嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)的使用范围扩大到面包、面粉、全麦面粉和非标准烘焙产品,同时修订允许的食品酶列表,并于2022年3月24日起生效。来自蛋白酶热解蛋白无氧芽孢杆菌TP7的嗜热菌蛋白酶已被允许用于某些水解食品,但它之前在允许的食品酶列表中作为“来自嗜热脂肪地芽孢杆菌TP7的蛋白酶”出现。其他来源的蛋白酶已被允许用于申请人所要求的相同食品中。

关键词：嗜热菌蛋白酶食品酶烘焙产品嗜热脂肪地芽孢杆菌加拿大卫生部全麦面粉面包

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用嗜热菌蛋白酶进行人肠上皮细胞分离培养

第三军医大学学报 2004年第11期26卷 1016-1018页

作者：张道杰蒋建新陈永华熊健琼段朝霞朱佩芳第三军医大学大坪医院野战外科研究所第四研究室

目的　探讨人肠上皮细胞 (intestinalepithelialcell,IEC)的分离、培养及鉴定方法 ,为进一步研究IEC提供合适的细胞模型。方法　取 4～ 6个月合法引产胎儿小肠 ,用嗜热菌蛋白酶消化分离IEC ,接种于含多种促IEC生长的营养成分的DMEM培养... 详细信息

目的　探讨人肠上皮细胞 (intestinalepithelialcell,IEC)的分离、培养及鉴定方法 ,为进一步研究IEC提供合适的细胞模型。方法　取 4～ 6个月合法引产胎儿小肠 ,用嗜热菌蛋白酶消化分离IEC ,接种于含多种促IEC生长的营养成分的DMEM培养液内 ,根据IEC和成纤维细胞贴壁时间的差异来纯化IEC ,通过观察IEC生长状态、形态特征、超微结构及检测上皮细胞膜抗原对IEC进行鉴定。结果　嗜热菌蛋白酶消化 2h可分离出大量的健全绒毛隐窝单位 ,进一步培养获得的IEC ,上皮细胞膜抗原均呈阳性。结论　选用嗜热菌蛋白酶作为分离IEC的消化酶 ,可获得较纯的IEC ,完全可供相关实验研究之用。

关键词：嗜热菌蛋白酶肠上皮细胞原代培养

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以甲壳胺为载体的固定化嗜热菌蛋白酶的研究

功能高分子学报 1989年第2期2卷 115-120页

作者：陶国良陈震华卓仁禧武汉大学化学系

本文报道了以甲壳胺为载体,采用戊二醛交联的方法将嗜热菌蛋白酶进行固定化。以酪蛋白为废物。固定化酶的活力回收为38％。本工作研究了各种因素对固定化酶活力的影响,实验结果表明:固定化后的酶,在热稳定性、抗抑制作用等方面较原酶有... 详细信息

本文报道了以甲壳胺为载体,采用戊二醛交联的方法将嗜热菌蛋白酶进行固定化。以酪蛋白为废物。固定化酶的活力回收为38％。本工作研究了各种因素对固定化酶活力的影响,实验结果表明:固定化后的酶,在热稳定性、抗抑制作用等方面较原酶有一定的提高。

关键词：嗜热菌蛋白酶甲壳胺固定化

应用嗜热菌蛋白酶快速分离活性纯椭圆囊感觉上皮细胞及其意义

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听力学及言语疾病杂志 2006年第5期14卷 351-353,362,i0001页

作者：刘俊孔维佳张亚民张丹华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科武汉430022

目的建立纯椭圆囊感觉上皮细胞(pure utricular sensory epithelial cell,PUSEC)的快速分离方法,为内耳细胞培养及毛细胞再生等机制研究提供大量的活性细胞。方法通过对出生5天大鼠PUSEC的形态、生长特征的观察,采用透射电镜,紧密联接蛋... 详细信息

目的建立纯椭圆囊感觉上皮细胞(pure utricular sensory epithelial cell,PUSEC)的快速分离方法,为内耳细胞培养及毛细胞再生等机制研究提供大量的活性细胞。方法通过对出生5天大鼠PUSEC的形态、生长特征的观察,采用透射电镜,紧密联接蛋白(ZO-1)、细胞角蛋白、波形蛋白免疫荧光细胞化学、RT-PCR检测毛细胞的特征性标志物Calretinin、Brn3.a mRNA的表达等方法鉴定PUSEC来源。结果PUSEC呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态,细胞之间连接紧密,形成单层时呈“铺路石样”外观。可见由成百个PUSEC包绕液体而成的dome。PUSEC表达ZO-1和细胞角蛋白,不表达波形蛋白,表达毛细胞的特征性标志物Calretinin、Brn3.a的mRNA。结论PUSEC来源于椭圆囊感觉上皮;纯椭圆囊感觉上皮细胞成功分离为内耳细胞培养及毛细胞再生机制的研究提供大量的活性细胞;成功分离的关键成份是嗜热菌蛋白酶。

关键词：嗜热菌蛋白酶椭圆囊感觉上皮细胞培养毛细胞再生支持细胞

微波辅助嗜热菌蛋白酶的固定化及其在阿斯巴甜前体合成中的应用

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微波辅助嗜热菌蛋白酶的固定化及其在阿斯巴甜前体合成中的应用

作者：陈飞飞杭州师范大学

学位级别：硕士

阿斯巴甜是一个二肽甜味剂,其甜度是蔗糖的200倍,味如白糖,不腻不苦,低热量可减肥,适合于肥胖症、心血管疾病、糖尿病等病人使用。目前低碳高效的合成阿斯巴甜前体的方法是嗜热菌蛋白酶催化法。但传统的酶催化合成阿斯巴甜前体过程中存... 详细信息

阿斯巴甜是一个二肽甜味剂,其甜度是蔗糖的200倍,味如白糖,不腻不苦,低热量可减肥,适合于肥胖症、心血管疾病、糖尿病等病人使用。目前低碳高效的合成阿斯巴甜前体的方法是嗜热菌蛋白酶催化法。但传统的酶催化合成阿斯巴甜前体过程中存在反应时间长、酶的回收利用率低、产物分离纯化困难、产率低等问题。本论文采用了一种氯化钠增溶及微波辅助的方法快速高效地制备了固定化嗜热菌蛋白酶,并且引进了小分子封闭的技术,提高了固定化酶的稳定性。将所得固定化酶应用于阿斯巴甜前体的合成中,不但提高了反应产率而且缩短了反应时间,提高了酶的回收利用率,简化了产物的分离纯化工作。本论文的主要内容及结论分为以下几个方面： (1)在固定化过程中加入3MNaCl提高嗜热菌蛋白酶的溶解性,用40W的微波对反应进行辐射使得固定化的负载率为93.2%;固定化酶的催化活力为17925.1U/mg,是常规固定化酶的4.5倍,是游离酶的1.6倍。固定化时间也从20h缩短到了3min,大约缩短了399倍。而且固定化提高了嗜热菌蛋白酶的热稳定性和耐有机溶剂的性能并且使酶能够回收利用,极大节约生产成本。 (2)在固定化过程中,载体的表面存在多余的活性基团影响固定化酶的稳定性。因此本文加入小分子物质封闭载体表面的多余基团,阻止其对固定化酶的迫害。丙氨酸、缬氨酸、色氨酸、叔戊醇等小分子都大大提高了固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性。 (3)在水相中以天然的嗜热菌蛋白酶为催化剂,Z-Asp-OH、Phe-OMe.HCl为底物,40W功率的微波辐射,30℃下反应10min,产物ZAPM的产率为60.91%,比常规反应高出了9个百分点。而反应时间从6h缩短到了10min,大约缩短了35倍。 (4)在乙酸乙酯-水双相系统中,微波固定化酶在氯化钙和氯化钠的协助下催化合成ZAPM,使得产率达到了28.3%,单位酶量单位时间内合成的ZAPM单位量达到了0.475/h,是Takeshi Nagayasu等人曾经报道的19倍。

关键词：微波辐射盐溶嗜热菌蛋白酶固定化多肽合成阿斯巴甜

注射用益气复脉联合用药安全性及嗜热菌蛋白酶固定化的研究

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注射用益气复脉联合用药安全性及嗜热菌蛋白酶固定化的研究

作者：赵志宇天津医科大学

学位级别：硕士

一、注射用益气复脉(冻干)与临床常用9种药物联合使用的安全性研究目的:通过小鼠耳廓蓝染类过敏实验、家兔滴注体温升高实验及溶血与凝血实验,对注射用益气复脉(冻干)(Yiqi Fumai Lyophilized Injection,YQFM)与9种临床常用药物联合使... 详细信息

一、注射用益气复脉(冻干)与临床常用9种药物联合使用的安全性研究目的:通过小鼠耳廓蓝染类过敏实验、家兔滴注体温升高实验及溶血与凝血实验,对注射用益气复脉(冻干)(Yiqi Fumai Lyophilized Injection,YQFM)与9种临床常用药物联合使用的类过敏反应、发热反应、溶血或凝聚反应进行研究。方法:(1)小鼠耳廓蓝染类过敏实验,尾静脉注射含有0.4%伊文思蓝(Evans blue,EB)的受试物生理盐水溶液。阳性对照组给予含有Compound 48/80-0.4%EB的生理盐水溶液;阴性对照组给予含有0.4%EB的生理盐水溶液;单独药物组给予“单独药物组-0.4%EB的生理盐水溶液”;混合药物组给予用“单独药物组-0.4%EB的生理盐水溶液”配制的YQFM。按照小鼠耳廓蓝染试验标准,对小鼠耳廓蓝染面积进行评估,并测定小鼠耳廓EB渗出量。(2)小鼠血液组胺检测实验,除将耳廓蓝染类过敏实验中全部0.4%EB生理盐水溶液换做生理盐水外,给药方法与之前相同。给药30 min后取血,用化学荧光方法测定小鼠血液组胺释放率。(3)家兔滴注体温升高实验,分为单独和混合给药组,耳缘静脉滴注受试物生理盐水溶液。测量家兔体温,按照发热反应判断标准对家兔体温变化进行评价。(4)溶血或凝聚实验,将阳性与阴性对照组、单独和混合给药组药液分别加入到2%红细胞混悬液中。37 C孵育3 h后,对溶血或凝聚反应进行观察。试管离心,在545 nm处测量上清液中血红素的吸光度,计算得到溶血率。结果:(1)维生素B6、盐酸纳洛酮注射液的单独与混合给药组,小鼠耳廓蓝染类过敏实验结果为阳性。(2)小鼠血液组胺含量,单独给药组与混合给药组之间无显著差异。(3)家兔滴注发热反应,仅氨茶碱注射液给药后家兔出现发热反应。(4)试管法溶血或凝聚实验中,单独与混合给药组实验结果均符合规定。(5)分光光度法与试管法实验结果存在一定差异,单独给药组中奥扎格雷和注射用环磷酰胺在全部给药剂量下,溶血率均小于5%;在混合给药组中,除氨茶碱、维生素B6和奥扎格雷注射液外,其他受试物的溶血率均小于5%。结论:(1)小鼠耳廓蓝染类过敏实验,混合给药组较单独给药组并无新增类过敏阳性结果出现。(2)家兔滴注发热反应实验,混合给药组较单独给药组体温变化无显著差异,发热反应与混合给药无关。(3)试管法与分光光度法对溶血或凝聚实验结果不一致。分光光度法可以量化溶血程度,结果可能更加准确。两种方法所得结果中,混合给药组较单独给药组均无新增溶血或凝聚反应的现象。二、仿生硅化固定嗜热菌蛋白酶用于制备低分子量鱼精蛋白的研究目的:仿生硅化方法固定嗜热菌蛋白酶(thermolysin,TLN),使用固定TLN酶解鱼精蛋白,分离纯化酶解产物,得到目标产物低分子量的鱼精蛋白(low molecular weight protamine,LMWP)。方法:(1)仿生硅烷固定TLN,四甲氧基硅烷(tetramethyl orthosilicate,TMOS)为仿生硅化前驱体;多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine,PLL)为生物模板。酸化后的TMOS加入到PLL和TLN的混合溶液中,反应5 min既得。(2)分离纯化LMWP,将固定TLN加入鱼精蛋白溶液中,使用快速蛋白液相色谱(Fast protein liquid chromatography,FPLC)对酶解产物分离纯化,得到LMWP。(3)优化LMWP分离纯化方法,在55%流动相B梯度前,加入低浓度梯度洗脱,以分离得到单个LMWP色谱峰。(2)优化TLN仿生硅化固定方法:使用DOE实验设计,对TLN、TMOS、PLL及酶解时间对固定TLN酶活性的影响进行研究,Minitab系统对结果进行分析,优化得到固定TLN方法。结果:(1)分离纯化LMWP洗脱过程:A:Tris-盐酸缓冲盐;B:Tris-盐酸和氯化钠缓冲盐为流动相。在前期洗脱程序的基础上增加洗脱梯度,洗脱条件确定为流动相B:0-20 min:33%;20-50 min:40%;50-70 min:55%;70-80 min:100%,分离得到单个LMWP色谱峰(2)选择TMOS浓度7.5%,PLL投入量0.3 mg,TLN加入量0.3 mg,酶解时间3.5 h为仿生硅烷方法固定TLN的实验条件。结论:本研究首次使用仿生硅化方法固定TLN。通过优化FPLC洗脱条件,分离得到单个LMWP色谱峰。使用DOE实验设计,Minitab软件对实验结果进行分析,优化得到仿生硅化固定TLN的条件。

关键词：注射用益气复脉(冻干) 配伍安全性类过敏反应发热反应溶血或凝聚反应嗜热菌蛋白酶仿生硅化方法低分子量鱼精蛋白

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柱状黄杆菌嗜热菌蛋白酶基因的鉴定

柱状黄杆菌嗜热菌蛋白酶基因的鉴定

作者：李军华南昌大学

学位级别：硕士

柱形病是一种全球性的危害极广的细菌性病，主要危害鱼类的鳃组织，也可引起体表溃烂，其病原为黄杆菌科的柱状黄杆菌(Flabobacterium columnare)。由该病原菌引起的细菌性烂鳃病在我国流行较广且危害严重，是草鱼(Ctenopharyngdon idel... 详细信息

柱形病是一种全球性的危害极广的细菌性病，主要危害鱼类的鳃组织，也可引起体表溃烂，其病原为黄杆菌科的柱状黄杆菌(Flabobacterium columnare)。由该病原菌引起的细菌性烂鳃病在我国流行较广且危害严重，是草鱼(Ctenopharyngdon idellus)、鳜(Siniperca chuatsi)等重要养殖鱼类的主要疾病。对该病原菌的研究表明其感染力与其对鳃组织的粘附力有关。蛋白酶、粘附因子和硫酸软骨素AC裂解酶被认为是F.columnare的毒力因子。细菌的外膜蛋白是细菌与细胞外环境相互作用的界面，是革兰氏阴性菌较为重要的免疫原。本研究以我国分离的引起柱形病的病原为对象，开展了F.columnare的毒力因子基因的鉴定方面的研究。构建F.columnare的三个平行表达文库，制备抗其外膜蛋白(OMPs)的兔抗。对文库进行影印后进行菌落原位杂交，挑取阳性克隆测序分析，采用基因组步移的方法进行全长克隆。从F.columnare的表达文库中筛选出嗜热菌蛋白酶(Thermolysin,TLN)基因，其开放阅读框包含2709nt，编码902aa。氨基酸序列比对发现TLN含有两个锌金属蛋白酶保守基序HExxH和GxxNExxSD。将TLN催化域和α螺旋域克隆至原核表达载体pET-32a(+)，转入大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)进行诱导表达，SDS-PAGE电泳显示重组融合蛋白TLN-C在分子量约58kD处有明显表达带，主要以不可溶的包涵体形式存在。变性条件下利用His·Bind树脂纯化融合蛋白，用其免疫新西兰大白兔，获得兔抗重组TLN-C多克隆抗体。用抗六个组氨酸的单抗或是兔抗重组蛋白多抗进行免疫印迹，这些抗体能有效地与重组蛋白(58 kD)结合，在F.columnare全菌蛋白和胞外蛋白约42kD处以及全菌蛋白和外膜蛋白约35kD处出现了阳性条带。

关键词：柱状黄杆菌嗜热菌蛋白酶外膜蛋白毒力因子

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分子模拟方法研究嗜热菌蛋白酶及其抑制剂

分子模拟方法研究嗜热菌蛋白酶及其抑制剂