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科学技术与工程 2014年第10期22卷 160-162页

作者：晏爱芬余丽林连兵保山学院资源环境学院保山678000 昆明理工大学生物工程技术研究中心昆明650224

从腾冲热海温泉中分离嗜热噬菌体,并初步分析其特征。采用双层平板法分离纯化嗜热噬菌体,对分离得到的噬菌体进行电镜形态观察和生理生化分析。结果从腾冲热海温泉中分离得到的噬菌体为长杆状;其感染宿主菌NJ2形成清晰的噬菌斑,最适感... 详细信息

从腾冲热海温泉中分离嗜热噬菌体,并初步分析其特征。采用双层平板法分离纯化嗜热噬菌体,对分离得到的噬菌体进行电镜形态观察和生理生化分析。结果从腾冲热海温泉中分离得到的噬菌体为长杆状;其感染宿主菌NJ2形成清晰的噬菌斑,最适感染温度为55℃,最适感染pH值为7.5。该噬菌体对氯仿不敏感;但其对非离子去垢剂SDS和对蛋白酶K敏感。将这株噬菌体命名为嗜热芽孢杆菌杆状噬菌体TBRP3(Thermophilic bacillus rod-shaped phage 3)。

关键词：嗜热噬菌体分离形态与生理特征

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深海嗜热噬菌体GVE2 HNH核酸内切酶生化性质及结构研究

深海嗜热噬菌体GVE2 HNH核酸内切酶生化性质及结构研究

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作者：黄彦超扬州大学

学位级别：硕士

HNH(His-Asn-His)核酸内切酶广泛分布于细菌、古菌、真核生物、病毒或噬菌体中,具有切割核酸的活性。目前,对于常温微生物的HNH核酸内切酶已经有较广泛的研究,但是源自嗜热噬菌体HNH核酸内切酶生化功能及结构的研究却鲜有报道。GVE2(Geo... 详细信息

HNH(His-Asn-His)核酸内切酶广泛分布于细菌、古菌、真核生物、病毒或噬菌体中,具有切割核酸的活性。目前,对于常温微生物的HNH核酸内切酶已经有较广泛的研究,但是源自嗜热噬菌体HNH核酸内切酶生化功能及结构的研究却鲜有报道。GVE2(Geobacillus virus E2)噬菌体分离于东太平洋深海热液区,其宿主菌为嗜热细菌Geobacillius sp.E263,该菌最适生长温度为60℃。GVE2噬菌体基因组测序已经完成,其编码一种HNH核酸内切酶。本论文首先将GVE2 HNH核酸内切酶的基因克隆至表达载体pET-30a(+),然后进行蛋白的诱导表达以及纯化,获得了重组的酶蛋白。其次,本文对该酶的生化性质进行了探讨。研究发现,重组的GVE2HNH核酸内切酶在60℃下具有非特异性DNA切割活性,能够切割线性λ DNA和闭合环状双链DNA。进一步的研究发现,该酶切割DNA的最适温度为60～65℃。热稳定性实验结果表明,该酶在100℃℃处理30 min后仍具有切割DNA的活性,证明其是一种耐热HNH核酸内切酶。该酶能够在pH 5.5到pH 9.0的的范围内对DNA进行切割,其最适反应pH值为8.0～9.0。此外,该酶活性依赖于二价金属离子:在Cu存在条件下,酶活性被抑制;在Mn、Mg、Ca、Fe、Co、Zn或Ni存在条件下,该酶均有不同的切割活性,其中Mn存在时具有最佳的切割DNA活性。另外,我们发现高浓度的NaCl能够抑制该酶的活性。与中国科学院高能物理研究所龚勇教授课题组合作,本论文解析了 GVE2 HNH核酸内切酶的晶体结构,其晶体包含一个保守的ββα-metal结构域,三个保守的氨基酸残基(H93、N109和H118)以及一个Zn原子结合位点。尽管GVE2 HNH核酸内切酶与Gme(Geobacter metallireducens)HNH核酸内切酶的晶体结构非常类似,但是两者存在不同。此外,我们还解析了 GVE2 HNH核酸内切酶分别与Mn和Zn形成复合物的晶体结构。结果表明,两者复合物的晶体类似,但也存在不同。为进一步阐明GVE2 HNH核酸内切酶的催化机理,本论文构建了 GVE2 HNH核酸内切酶H93A、N109A和H118A突变体,并纯化得到了这三个突变体蛋白。圆二色光谱实验结果表明,H93A取代未引起GVE2HNH核酸内切酶二级结构的变化。但是,H118A取代明显地改变了该酶的二级结构,而N109A取代中度地改变了该酶的二级结构。与野生型蛋白相比,这三个突变体蛋白热稳定性均降低,暗示着这三个氨基酸残基的改变与该酶的耐热性相关。另外,我们分析了 GVE2HNH核酸内切酶H93A、N109A和H118A突变体切割DNA的效率。研究发现,与野生型GVE2 HNH核酸内切酶相比,H93A、N109A和H118A突变体的活性分别损失了96%、60%和83%。此外,我们探讨了不同浓度Mn和Zn对野生型及突变体GVE2 HNH核酸内切酶切割DNA活性的影响。研究发现,尽管Mn或Zn存在时,野生型酶蛋白均能够切割DNA,但是切割模式不同。Mn存在时,H93 A突变体几乎不能切割DNA活性,而N109A和H118A突变体具有减弱的切割活性;存在Zn时,H93A、N109A和H118A均不能切割DNA。此外,我们还发现,该酶结合Mn的能力要强于结合Zn的能力,从而为解释Mn是该酶的最佳金属离子提供了依据。本论文首次揭示了深海嗜热噬菌体GVE2 HNH核酸内切酶的生化性质、结构特征和催化机理,为阐明该酶在噬菌体GVE2生命周期中发挥的作用提供了理论基础,也为分子生物学及生物技术领域提供了嗜热的HNH核酸内切酶。

关键词：嗜热噬菌体核酸内切酶晶体结构 HNH结构域生化性质

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嗜热芽孢杆菌噬菌体的分离及特征研究

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生物技术通讯 2013年第1期24卷 80-82页

作者：晏爱芬余丽林连兵保山学院资源环境学院云南保山678000 昆明理工大学生物工程技术研究中心云南昆明650224

目的:从腾冲热海温泉中分离嗜热芽孢杆菌噬菌体,并初步分析其特征。方法:采用双层平板法分离纯化嗜热芽孢杆菌噬菌体,对分离得到的噬菌体进行电镜形态观察,按照感染复数(MOI)分别为0.01、0.1、1.0、10和100加入噬菌体纯培养液和宿主菌,5... 详细信息

目的:从腾冲热海温泉中分离嗜热芽孢杆菌噬菌体,并初步分析其特征。方法:采用双层平板法分离纯化嗜热芽孢杆菌噬菌体,对分离得到的噬菌体进行电镜形态观察,按照感染复数(MOI)分别为0.01、0.1、1.0、10和100加入噬菌体纯培养液和宿主菌,55℃、160 r/min培养8 h后测定噬菌体滴度,并进行噬菌体的热稳定性和pH稳定性分析。结果:从腾冲热海温泉中分离得到的噬菌体为二十面体型;其感染宿主菌NHH4形成清晰的噬菌斑,最适MOI为1.0,最适感染温度为55℃,最适感染pH值为7.5。将这株噬菌体命名为TBIP1。结论:从腾冲热海温泉中分离得到的噬菌体TBIP1为典型的二十面体型,当MOI为1.0时,TBIP1感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高。

关键词：嗜热噬菌体嗜热芽孢杆菌分离形态与生理特征

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腾冲热海一株栖热菌裂解性噬菌体的分离及其特征

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微生物学报 2010年第3期50卷 322-327页

作者：洪伟韩剑戴欣季秀玲魏云林林连兵昆明理工大学生物工程技术研究中心昆明650224 中国科学院微生物研究所北京100101

【目的】Thermus(栖热菌)属是嗜热细菌中比较古老的类群,本研究探索从腾冲热海热泉分离栖热菌噬菌体,并初步分析其特征。【方法】采用"双层平板法"从云南腾冲热海碱性热泉中分离纯化栖热菌噬菌体;对噬菌体及其宿主进行电镜形态观察,并... 详细信息

【目的】Thermus(栖热菌)属是嗜热细菌中比较古老的类群,本研究探索从腾冲热海热泉分离栖热菌噬菌体,并初步分析其特征。【方法】采用"双层平板法"从云南腾冲热海碱性热泉中分离纯化栖热菌噬菌体;对噬菌体及其宿主进行电镜形态观察,并进行噬菌体基因组限制性酶切片段多态性分析、噬菌体生理特征及蛋白组成分析。【结果】从腾冲热海热泉分离获得1株裂解性噬菌体,其宿主菌TC10通过16S rRNA基因序列分析鉴定为Thermus属菌株。此噬菌体为长尾型,头部直径67nm,尾管长837nm、宽10nm,最适感染温度为65℃-70℃,最适感染pH值为7.6,对氯仿不敏感,其形态与分离自俄罗斯勘察加半岛热泉的栖热菌噬菌体P23-45和P74-26有一定的差异,蛋白组成差异显著,为一株新的栖热菌噬菌体,命名为TTSP10(Tengchong Thermus Siphoviridae Bacteriophage)。

关键词：栖热菌嗜热噬菌体 TTSP10(Tengchong Thermus Siphoviridae phage) 形态与生理特征

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