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吉林省部分地区蜱和羊携带羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体分子流行病学调查

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中国兽医杂志 2023年第6期59卷 9-15页

作者：田万年张子健迟雪吉林农业科技学院动物科技学院吉林吉林132101

为调查吉林省部分地区蜱虫和羊体内羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体的流行情况,本试验采用PCR方法对采自吉林省5个地区的340份羊血液样本和841份蜱虫样本进行检测,并对部分阳性样本测序,建立系统发育树。结果显示,蜱虫中羊泰勒虫和嗜吞噬细... 详细信息

为调查吉林省部分地区蜱虫和羊体内羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体的流行情况,本试验采用PCR方法对采自吉林省5个地区的340份羊血液样本和841份蜱虫样本进行检测,并对部分阳性样本测序,建立系统发育树。结果显示,蜱虫中羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体阳性率分别为4.64%(39/841)和7.13%(60/841);羊血液样本中羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体阳性率分别17.06%(58/340)和10.00%(34/340),混合感染率为3.24%(11/340)。蜱虫和羊血液样本中感染的羊泰勒虫为吕氏泰勒虫单独感染,未检测到尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫。系统发育树分析显示,蜱虫和羊血液样本中检测到的泰勒虫与吕氏泰勒虫处于同一分支,与吕氏泰勒虫河南株亲缘关系较近,与尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫亲缘关系较远;蜱虫和羊血液样本中检测到的嗜吞噬细胞无浆体与韩国株、俄罗斯株处于同一分支,亲缘关系较近。结果表明,吉林省羊泰勒虫和嗜吞噬细胞无浆体感染普遍存在。本调查结果为吉林省羊泰勒虫病和嗜吞噬细胞无浆体病的综合防治提供了理论依据。

关键词：羊泰勒虫嗜吞噬细胞无浆体分子流行病学系统进化分析蜱

嗜吞噬细胞无浆体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

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中国兽医学报 2018年第4期38卷 722-726,735页

作者：崔艳艳王晓星张艳史柯菅复春张龙现王荣军宁长申河南农业大学牧医工程学院

为建立荧光定量PCR方法检测嗜吞噬细胞无浆体（Anaplasma phangocytophilum），针对GenBank *** 16S rRNA基因保守序列（JN558815），设计1对引物1—25F／183—205R。以已知引物EE1／EE2和该引物进行巢式PCR扩增出预期大小片段（205bp... 详细信息

为建立荧光定量PCR方法检测嗜吞噬细胞无浆体（Anaplasma phangocytophilum），针对GenBank *** 16S rRNA基因保守序列（JN558815），设计1对引物1—25F／183—205R。以已知引物EE1／EE2和该引物进行巢式PCR扩增出预期大小片段（205bp），构建合有16srRNA基因的重组质粒，以质粒为模板构建了标准曲线。以1—25F／183—205R为荧光定量PCR引物，建立*** philum荧光定量PCR检测方法，并进行特异性、敏感性、重复性试验和临床样本检测。结果表明，该方法在6．4×10^3～6．4×10^8copies／μL相关系数为0．99，显示出良好的线性关系；所建方法能特异地检出***，对绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫基因组DNA和灭菌双蒸水均无交叉反应；可检测到6．4×10^2copies／μL的标准质粒DNA，比常规PCR敏感性高100倍；批内及批间变异系数均低于2．0％，具有较高的重复性和稳定性；利用该方法对30份羊血液临床样品检出率比巢式PCR高16．67％。该研究为***临床检测和定量分析病原感染程度奠定理论基础。

关键词：嗜吞噬细胞无浆体荧光定量PCR 16S rRNA基因

嗜吞噬细胞无浆体和牛无浆体LAMP检测方法的建立与应用

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嗜吞噬细胞无浆体和牛无浆体LAMP检测方法的建立与应用

作者：王金鸿河南农业大学

学位级别：硕士

无浆体病(Anaplasmosis),旧称边虫病,是由各种无浆体(Anaplasma)经蜱传播而寄生于牛、羊、鹿等动物包括人的血细胞内,引起患病动物及人的一种慢性或急性传染性血液寄生虫病。该病主要引起动物的体重下降,产奶量下降,流产等,严重者可导... 详细信息

无浆体病(Anaplasmosis),旧称边虫病,是由各种无浆体(Anaplasma)经蜱传播而寄生于牛、羊、鹿等动物包括人的血细胞内,引起患病动物及人的一种慢性或急性传染性血液寄生虫病。该病主要引起动物的体重下降,产奶量下降,流产等,严重者可导致死亡,造成严重的经济损失。已知的无浆体病病原包括边缘无浆体(A. marginale)、中央无浆体(***)、嗜吞噬细胞无浆体(A. phagocytophilum)、绵羊无浆体(***)、牛无浆体(A. bovis)和扁平无浆体(A. platys)。建立高效、快速、准确的诊断方法,对该病的诊断及防控具有重要意义。本研究旨在建立特异性强、灵敏度高、操作简便且快速的环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)以检测嗜吞噬细胞无浆体和牛无浆体。利用实验室保存的嗜吞噬细胞无浆体阳性血液DNA样品建立LAMP方法。使用Primer Explorer V4(http://***/elamp4.0.0/***),根据嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因设计4条特异引物,初步建立并优化LAMP反应条件以快速检测嗜吞噬细胞无浆体。结果发现,最佳反应温度和反应时间分别是65℃和60min,在25μL反应体系中,MgSO4、 dNTP Mixture、Betaine 和 Bst DNA聚合酶的最佳浓度分别是8mM、1.4 mM、0.6 M和8U/25μL。该方法具有良好的敏感性和特异性,检测灵敏度为1个拷贝/μL,对采集的94份羊血液样品使用该方法和巢式PCR方法分别检测,阳性率分别为56.38%和12.77%;且与牛无浆体、绵羊无浆体、吕氏泰勒虫、莫氏巴贝斯虫、血吸虫无交叉反应。添加SYBR GreenⅠ染料可快速检测嗜吞噬细胞无浆体。取巢式PCR检测嗜吞噬细胞无浆体为阳性和阴性的羊血液DNA样品各10份,应用本研究建立的LAMP方法与Lei、Lee建立的LAMP方法进行检测,阳性检出率分别为90%、20%和0,均未见假阳性,可见,本研究建立的方法更敏感。由上述结果可知,本研究建立的LAMP方法可以有效的检测嗜吞噬细胞无浆体感染。根据NCBI中牛无浆体16S rRNA基因序列设计可检测牛无浆体的LAMP引物,建立一种快速检测牛无浆体的LAMP方法。实验结果表明,该方法的最佳反应温度和时间分别为62℃和60 min,在25μL反应体系中,MgSO4、dNTP Mixture、Betaine 和 Bst DNA聚合酶的最佳浓度分别是8mM、1.0 mM、0.6 M和8U/25μL。该方法敏感性和特异性都较好,检测灵敏度为1个拷贝/μL,对采集的120份羊血液样品使用该方法和巢式PCR进行检测,阳性率分别为67.50%和37.83%;且不与嗜吞噬细胞无浆体、绵羊无浆体、吕氏泰勒虫、莫氏巴贝斯虫、血吸虫发生交叉反应。添加SYBR Green I染料可快速检测出牛无浆体。目前,国内外尚无关于牛无浆体的LAMP报道。由上述结果可知,本研究建立的LAMP方法可以有效检测牛无浆体感染。本研究建立的嗜吞噬细胞无浆体和牛无浆体LAMP检测方法,具有良好的敏感性和特异性,且均优于现有的检测方法,为嗜吞噬细胞无浆体和牛无浆体病原检测提供了新的技术方法。

关键词：嗜吞噬细胞无浆体牛无浆体 LAMP 检测建立

新疆北部地区蜱传嗜吞噬细胞无浆体病原学检测与分子遗传进化分析

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动物医学进展 2021年第2期42卷 19-25页

作者：吴泽功林汉亮罗金马力克•艾则孜任巧云罗毅马站殷宏李奎刘光远河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002 中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜动物疫病国家重点实验室甘肃兰州730046 新疆维吾尔自治区动物卫生监督所新疆乌鲁木齐830011 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为调查我国新疆北部地区蜱及牛、羊体内蜱传播性嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasma phagocytophilum)病原的流行情况,收集了新疆北部地区13个县(市)的蜱虫样品及血液样品(蜱虫样品609只,牛血液样品670份,羊血液样品631份),提取基因组DNA,PCR... 详细信息

为调查我国新疆北部地区蜱及牛、羊体内蜱传播性嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasma phagocytophilum)病原的流行情况,收集了新疆北部地区13个县(市)的蜱虫样品及血液样品(蜱虫样品609只,牛血液样品670份,羊血液样品631份),提取基因组DNA,PCR检测后挑选阳性样品测序(1/3),分析其感染状况及病原分子遗传特征。结果显示,蜱虫和血液样品中共检测出183份***感染阳性,牛、羊和蜱虫感染率分别为10.0%(67/670)、9.5%(60/631)和8.2%(50/609),样品总体感染率为9.3%(177/1910)。此次获得的新疆北部地区*** 16S rRNA和MSP 4基因序列遗传进化分析显示,该区牛、羊和蜱体内检测到的病原基因阳性片段与GenBank已公布的中亚、中欧地区病原基因序列同源性为96.7%~99.5%,进化树分析显示与中亚、中欧多国***基因序列聚为一支。结果可为新疆北部地区蜱与蜱传播性嗜吞噬细胞无浆体病的防控提供理论依据。

关键词：蜱人畜共患病原嗜吞噬细胞无浆体病原学检测遗传进化分析

嗜吞噬细胞无浆体LAMP检测方法的建立与应用

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嗜吞噬细胞无浆体LAMP检测方法的建立与应用

嗜吞噬细胞无浆体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

2017年全国养羊生产与学术研讨会暨养羊学分会第七次全国会员代表大会

作者：王金鸿张艳王晓星崔艳艳闫亚群王荣军菅复春张龙现宁长申河南农业大学牧医工程学院

引言嗜吞噬细胞无浆体,旧称人粒细胞埃里希氏体,是人粒细胞无形体病(HGA)和动物蜱传热病的致病原。目前检测嗜吞噬细胞无浆体感染最常用的方法是镜检和血清学诊断,但前者易漏检,后者则由于交叉反应常出现误诊。随着分子生物学技术的发展... 详细信息

引言嗜吞噬细胞无浆体,旧称人粒细胞埃里希氏体,是人粒细胞无形体病(HGA)和动物蜱传热病的致病原。目前检测嗜吞噬细胞无浆体感染最常用的方法是镜检和血清学诊断,但前者易漏检,后者则由于交叉反应常出现误诊。随着分子生物学技术的发展,PCR方法被广泛用来检测嗜吞噬细胞无浆体,然而常规PCR敏感性较差,巢式PCR费时且易污染,实

关键词：人畜共患病致病原嗜吞噬细胞无浆体 LAMP检测靶向基因

来源： cnki会议评论

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嗜吞噬细胞无浆体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

嗜吞噬细胞无浆体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

第十六届（2019）中国羊业发展大会暨庆阳农耕文化节

作者：崔艳艳王晓星张艳史柯菅复春张龙现王荣军宁长申河南农业大学牧医工程学院

为建立荧光定量PCR方法检测嗜吞噬细胞无浆体(***),针对*** 16S rRNA基因保守序列(JN558815),设计1对引物1-25 F/183-205R。以已知引物EE1/EE2和该引物进行巢式PCR扩增出预期大小片段(205bp),构建含有16Sr RNA基因的重组质粒,以质粒为... 详细信息

为建立荧光定量PCR方法检测嗜吞噬细胞无浆体(***),针对*** 16S rRNA基因保守序列(JN558815),设计1对引物1-25 F/183-205R。以已知引物EE1/EE2和该引物进行巢式PCR扩增出预期大小片段(205bp),构建含有16Sr RNA基因的重组质粒,以质粒为模板构建了标准曲线。以1-25 F/183-205R为荧光定量PCR引物,建立了A. phagocytophilum荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性试验和临床样本检测。结果表明,该方法在6.4×10～6.4×10 copies/μL范围内相关系数为0.99,显示出良好的线性关系;所建方法能特异地检出A. phagocytophilum,对绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫基因组DNA和灭菌双蒸水均无交叉反应;可检测到6.4×10copies/μL的标准质粒DNA,比常规PCR敏感性高100倍;批内及批间变异系数均低于2%,具有较高的重复性和稳定性;利用该方法对30份羊血液临床样品检出率比巢式PCR高16.67%。该研究为A. phagocytophilum临床检测和定量分析病原感染程度奠定了基础。

关键词：嗜吞噬细胞无浆体荧光定量PCR 16Sr RNA基因

来源： cnki会议评论

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嗜吞噬细胞无浆体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

新疆昭苏县马感染嗜吞噬细胞无浆体血清学与分子生物学调查

2017年全国养羊生产与学术研讨会暨养羊学分会第七次全国会员代表大会

作者：崔艳艳王晓星张艳史柯菅复春张龙现王荣军宁长申河南农业大学牧医工程学院

引言嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasma phagocytophilum,AP)隶属立克次体目、无浆体科、无浆体属,是主要经蜱传播、专性细胞内寄生的人兽共患病病原体,严重威胁人和动物健康。目前AP的检测主要有形态学、分子生物学方法、血清学检查和PCR、L... 详细信息

引言嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasma phagocytophilum,AP)隶属立克次体目、无浆体科、无浆体属,是主要经蜱传播、专性细胞内寄生的人兽共患病病原体,严重威胁人和动物健康。目前AP的检测主要有形态学、分子生物学方法、血清学检查和PCR、LAMP技术等,但均存在一定的局限性。本研究旨在建立AP SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行评价分析,以期为AP病原检测和定量分析病原感染程度奠定基础。

关键词：人兽共患病病原体嗜吞噬细胞无浆体荧光检测聚合酶链式反应

来源： cnki会议评论

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动物医学进展 2018年第7期39卷 47-51页

作者：李烛南卢怡竹王振国刘志杰殷宏曾巧英甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

马属动物是嗜吞噬细胞无浆体的重要天然宿主,旨在弄清新疆昭苏县马感染嗜吞噬细胞无浆体情况和病原特征。对采集的100份马血清进行间接免疫荧光(IFA)检测嗜吞噬细胞无浆体抗体,对阳性样品相对应的DNA样品通过PCR扩增、16S rRNA基因测序... 详细信息

马属动物是嗜吞噬细胞无浆体的重要天然宿主,旨在弄清新疆昭苏县马感染嗜吞噬细胞无浆体情况和病原特征。对采集的100份马血清进行间接免疫荧光(IFA)检测嗜吞噬细胞无浆体抗体,对阳性样品相对应的DNA样品通过PCR扩增、16S rRNA基因测序、序列比对、完成了分子分型分析。间接免疫荧光法(IFA)检出率为8%(8/100),通过对阳性样品的基因组进行16S rRNA扩增,序列分析进一步确定马存在嗜吞噬细胞无浆体感染情况。分子分型发现存在2种嗜吞噬细胞无浆体基因型,ZS23和ZS40这2种基因型在我国及周边其他国家均有分布,研究结果将为该地区的嗜吞噬细胞无浆体感染情况的调查和防治提供依据。

关键词：嗜吞噬细胞无浆体间接免疫荧光 16SrRNA 分子分型

羊吕氏泰勒虫与嗜吞噬细胞无浆体双重PCR检测方法的建立与应用

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羊吕氏泰勒虫与嗜吞噬细胞无浆体双重PCR检测方法的建立与应用

作者：闫亚群河南农业大学

学位级别：硕士

羊泰勒虫病(Ovine Theileriosis)是由寄生在绵羊和山羊红细胞、淋巴细胞或巨噬细胞内的泰勒科(Theileriidae)泰勒属(Theileria)的血液寄生原虫引起的一类疾病的总称;无浆体病(Anaplasmosis)是由无浆体科(Anaplasmataceae)无浆体(Anaplasma)属病原寄生于人和动物血细胞内引起的蜱传性血液立克次体病。羊泰勒虫病和无浆体病均属于蜱传性疾病,引起人和动物极为类似的高热、贫血、黄疸和消瘦等临床症状,严重感染时可导致死亡。吕氏泰勒虫(***)是一种恶性羊泰勒虫,具有很强的致病性;嗜吞噬细胞无浆体(***,AP)作为一种人兽共患病病原,严重威胁着人和动物的健康,临床常见两种病原混合感染。目前,针对这两种病原的检测主要是常规PCR方法,但一次仅限于一种特定病原的检查,而在临床应用中耗费人力物力。迄今为止,关于同时检测***和AP的PCR诊断方法,未见报道。本研究旨在建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好的双重PCR检测方法,以期能够同时检测***和AP,为两种病原快速检测及其所致疫病的快速诊断提供技术方法。1.吕氏泰勒虫PCR方法的建立及应用为建立灵敏度高、特异性强的羊吕氏泰勒虫检测方法,本研究根据Gen Bank上发表的***(登录号:KC735166.1)18S r RNA基因序列设计引物***7F/***7R,建立PCR检测方法。优化该方法的最佳反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性、重复性试验及临床样品检测。结果表明,所建立的羊吕氏泰勒虫PCR检测方法能特异性扩增出962bp目的片段,而与尤氏泰勒虫(***)、绵羊泰勒虫(***)、环形泰勒虫(***)、莫氏巴贝斯虫(Babesia motasi)和刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)均无交叉反应;*** DNA最大稀释倍数为10-7,即DNA最低检测量为29.13 fg·μL-1;且重复性好;应用所建PCR方法和报道的PCR方法分别对76份羊临床血液样品检测,结果显示该方法***阳性检出率为77.63%(59/76),高于已报道PCR方法的阳性检出率(60.53%,46/76),检出率差异具有统计学意义(0.01

关键词：双重PCR 绵羊山羊吕氏泰勒虫嗜吞噬细胞无浆体 18SrRNA基因 16SrRNA基因