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Akkermansia muciniphila源唾液酸糖苷酶基因的克隆表达与酶学特性研究

Akkermansia muciniphila源唾液酸糖苷酶基因的克隆表达与酶学特...

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作者：黄坤南京农业大学

学位级别：硕士

唾液酸又称为神经氨酸,是一类广泛分布于生物体中的九碳单糖酸。在自然界中,通常以α 2,3或α 2,6糖苷键连接在半乳糖上,α 2,6糖苷键连接在N-乙酰半乳糖胺上和α 2,8糖苷键连接在其它唾液酸上。唾液酸糖苷酶是一类能够识别并水解糖复... 详细信息

唾液酸又称为神经氨酸,是一类广泛分布于生物体中的九碳单糖酸。在自然界中,通常以α 2,3或α 2,6糖苷键连接在半乳糖上,α 2,6糖苷键连接在N-乙酰半乳糖胺上和α 2,8糖苷键连接在其它唾液酸上。唾液酸糖苷酶是一类能够识别并水解糖复合物非还原末端唾液酸残基的α外切糖苷水解酶,是糖链结构分析中的重要工具酶。Akkermansia muciniphila是一种新发现的人体肠道益生菌,革兰氏阴性,严格厌氧,能够水解粘蛋白上的寡糖链来为其自身的生长繁殖提供碳源、氮源和能源。Akkermansia muciniphila的全基因组测序已经完成,通过生物信息学手段分析发现,在该菌的全基因组中含有编码唾液酸糖苷酶基因的序列,而在以前的研究当中,亦有关于该菌能够表达唾液酸糖苷酶的报道。本研究在上述信息基础上,拟从Akkermansia muciniphila中挖掘新的唾液酸糖苷酶。首先通过分子生物学技术,本研究成功的从Akkermansia muciniphila中克隆得到4种唾液酸糖苷酶基因,分别为Am0705、Am0707、Am1757和Am2085,并在β半乳糖糖苷酶基因被敲除的*** BL21(DE3)细胞中进行了异源重组表达,通过Nickel-NTA 一步纯化得到单一条带的蛋白质。合适的底物是酶活性检测和酶学特性研究的基础。为了更好的模拟自然界中唾液酸在复合物中的存在形式,本研究利用文献报道的源自美人鱼发光杆菌(Photobacserium damesl)的唾液酸糖基转移酶PdST6、源自空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的唾液酸糖基转移酶CjST8、源自脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的CMP-Sia合成酶NmCTT和源自发酵成对杆菌(Dyadobbacter fementans)的唾液酸醛缩酶DfNeuLy,以X-Gal作为唾液酸糖基受体,通过一锅多酶法和C18固相萃取柱成功的合成并纯化得到8种不同的唾液酸糖苷类化合物,分别为 X-Gal α 2,3 Neu5Ac、X-Gal α 2,6 Neu5Ac、X-Gal α 2,3 Neu5Gc、X-Gal α 2,6 Neu5Gc、X-Gal α 2,3 KDN、X-Gal α 2,6 KDN、X-Gal α 2,3 Neu5Prop 和 X-Gal α 2,6 Neu5Prop。该唾液酸糖苷类化合物比通常所用的底物如pNP-Sia更接近唾液酸的自然存在形式,因此结果具有更高的可信度。以X-Gal α 2,3 Neu5Ac和X-Gal α 2,6 Neu5Ac为底物检测重组酶活性,结果表明,4种重组酶都具有酶活性。以上述合成的8种唾液酸糖苷类化合物作为底物研究4种重组唾液酸糖苷酶的底物特异性,结果表明,4种重组酶都能够水解α 2,3和α 2,6唾液酸糖苷键,而且对X-Gal α 2,3 Neu5Ac 的水解活性最好,然而对 X-Gal α 2,3 KDN 和 X-Gal α 2,6 KDN的水解能力最弱,因此,以X-Gal α 2,3 Neu5Ac为底物,进一步研究4种重组唾液酸糖苷酶的酶学特性。研究表明,Am0705、Am0707、Am1757和Am2085的最适pH分别为8.0、6.0、7.5和7.0。最适温度分别为42℃、42℃、37℃和37℃。Am0705、Am0707、Am1757 和Am2085 的Km值分别为106μmol/L、80μmol/L、121 μmol/L 和 101 μmol/L,Vmax 分别为 50.6 μmol/min、6.6 μmol/min、27.5μmol/min 和 10.4 μmol/min。EDTA 能够完全抑制 Am0705、Am0707、Am1757 和Am2085的活性,然而Am0707却能够保持57.9%的活性;Cu2+和Zn2+能够完全抑制4种酶的酶活性;Fe2+显著提高Am0705的酶活性至179.9%,然而却完全抑制Am2085的酶活性;Fe3+显著提高Am2085的酶活性至145.1%。本研究成功的从人体肠道共生菌Akkermansia muciniphila中克隆得到4种唾液酸糖苷酶同工酶基因。同时以X-Gal作为唾液酸糖基受体,采用一锅多酶法成功合成更好模拟唾液酸自然存在形式的8种唾液酸糖苷类化合物。以该化合物为底物研究4种重组酶的底物特异性,结果表明,4种同工酶具有广泛的底物识别范围,不仅能够水解α 2,3和α 2,6连接的唾液酸,而且还能水解不同结构的唾液酸。因此,本研究结果为含唾液酸寡糖链结构分析提供4种可能的工具酶。此外,利用包括4种酶在内的"一锅多酶法"成功合成了以X-Gal为唾液酸糖基受体的8种唾液酸糖苷类化合物,为唾液酸糖苷酶研究提供更为可靠的底物。

关键词：唾液酸糖苷酶 Akkermansiamuciniphila 酶学特性唾液酸糖苷类化合物

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