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唾液酸糖苷类化合物的全酶法合成、纯化及结构鉴定

唾液酸糖苷类化合物的全酶法合成、纯化及结构鉴定

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作者：郭娟南京农业大学

学位级别：硕士

唾液酸作为重要的生物信息传递分子,在生物体内有着十分重要的生物学功能。而合成唾液酸糖苷类化合物可以为研究其竞争唾液酸受体结合位点和进一步探讨生物机体内唾液酸代谢过程及其作用机制提供材料。目前利用化学合成法和天然提取法... 详细信息

唾液酸作为重要的生物信息传递分子,在生物体内有着十分重要的生物学功能。而合成唾液酸糖苷类化合物可以为研究其竞争唾液酸受体结合位点和进一步探讨生物机体内唾液酸代谢过程及其作用机制提供材料。目前利用化学合成法和天然提取法制备唾液酸糖苷类化合物,其产物收率效益较低,反应条件苛刻,且会对环境造成较大的污染,可见简单的天然提取和化学合成过程并不能满足唾液酸糖苷类化合物的生产需求。因此本研究探索了脱乙酰基酶在37℃无保护基团的条件下催化N-乙酰化反应的作用,以期替代化学-酶法合成途径中的化学合成过程,完善多种唾液酸糖苷类化合物的全酶法合成途径。此外唾液酸醛缩酶是酶法合成唾液酸糖苷类化合物途径中的关键酶,而目前已挖掘的商品型唾液酸醛缩酶价格较为昂贵,且多需在培养基中添加N-乙酰神经氨酸作为诱导剂才可表达生成,因此本论文拟从***基因组中挖掘编码唾液酸醛缩酶的基因PhNeuLy3300,构建其工程菌进行体外异源表达,结合本实验室发掘的四种工具酶,探索“一釜五酶”法合成多种唾液酸糖苷类化合物的途径。目前关于各类方法合成所得的唾液酸糖苷类化合物还缺乏结构鉴定的相关研究,本论文将对合成的产物继续纯化并利用核磁共振仪器进行结构分析,以填补目前存在的空白,进一步分析该全酶法合成途径的特点。具体研究内容和结果如下:1.唾液酸醛缩酶的重组表达、酶活检测及脱乙酰基酶的N-乙酰化活性研究以细菌属Pedobacter heparinus作为研究菌株,通过生物信息同源比对,找到其编码唾液酸醛缩酶的基因PhNeuLy3300。利用基因工程手段构建PhNeuLy3300的工程菌,并进行体外异源表达及纯化,经SDS聚丙烯酰胺凝狡电泳检测证明,纯化后可以得到纯度较高的重组唾液酸醛缩酶。酶标仪法检测酶活结果表明,该PhNeuLy3300酶具有较好的活性,能作为唾液酸糖苷类化合物合成途径中的关键酶使用。以CmCBDA脱乙酰基酶分别催化D-盐酸氨基葡萄糖和4种不同的有机酸(乙酸或丙酸或羟基乙酸或巯基乙酸)发生N-乙酰化反应,经1H-N-MR分析,本研究成功合成了N-乙酰葡萄糖胺、N-丙酰葡萄糖胺、N-羟乙酰葡萄糖胺及N-巯基乙酰葡萄糖胺,且产物产率依次为69%、68%、77%及77%,证明该脱乙酰基酶能成功催化D-盐酸氨基葡萄糖和各类有机酸发生N-乙酰化反应,作为探索全酶法合成唾液酸糖苷类化合物途径的工具酶。2.全酶法合成4种唾液酸糖普类化合物以D-盐酸氨基葡萄糖和4种不同的有机酸(乙酸或丙酸或羟基乙酸或琉基乙酸)分别为底物,使用定量的PhNeuLy3300酶及本实验室保藏的CmCBDA酶(脱乙酰基酶)、PhGn2E3295酶(N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶)、NmCTT酶(CMP-唾液酸合成酶)、PdST6酶(唾液酸糖基转移酶)—“一釜五酶”合成多种唾液酸糖苷类化合物,经高效液相色谱-质谱联用仪检测结果表明,该全酶法合成唾液酸糖苷类化合物途径成功合成了 X-Gal-N-乙酰神经氨酸、X-Gal-N-丙酰神经氨酸、X-Gal-N-羟乙酰神经氨酸及X-Gal-N-琉基乙酰神经氨酸4种唾液酸糖苷类化合物,其产率依次为98%、94%、29%及92%,表明该全酶法合成途径可行并且具有较高的产物转化率。此外,该全酶法合成途径反应条件温和,操作简单,且无需特殊的化学反应设备及有毒试剂,因此不会造成环境污染等问题。3.产物的纯化及核磁共振分析由C18固相萃取柱及硅胶柱对含X-Gal-N-乙酰神经氨酸、X-Gal-N-丙酰神经氨酸、X-Gal-N-羟乙酰神及X-Gal-N-巯基乙酰神经氨酸产物的反应样液进行去酶、盐、X基团,高效液相色谱检测结果显示无杂峰,证明得到的产物纯度较高,且无副产物生成。经核磁共振仪对纯化后的样品X-Gal-N-乙酰神经氨酸、X-Gal-N-丙酰神经氨酸、X-Gal-N-羟乙酰神进行1H-NMR、13C-NMR分析,结果表明产物与理论目标产物结构一致,无杂质信号峰出现,即证明该全酶法合成途径具有提取简单、产品纯度高等优点。

关键词：唾液酸唾液酸醛缩酶一釜五酶法唾液酸糖苷类化合物核磁共振

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全酶法合成唾液酸糖苷类化合物的途径

全酶法合成唾液酸糖苷类化合物的途径

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第十一届中国酶工程学术研讨会

作者：郭娟刘丽 Pedro Laborda Josef Voglmeir Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center 南京农业大学

唾液酸糖苷类化合物是重要的生物信息传递分子,细胞表面糖蛋白和糖脂的唾液酸化修饰在许多生物过程中发挥着至关重要的作用,目前唾液酸糖苷类化合物的合成方法主要有化学合成法,化学-酶法合成法以及天然产物提取法等。使用化学合成和天... 详细信息

唾液酸糖苷类化合物是重要的生物信息传递分子,细胞表面糖蛋白和糖脂的唾液酸化修饰在许多生物过程中发挥着至关重要的作用,目前唾液酸糖苷类化合物的合成方法主要有化学合成法,化学-酶法合成法以及天然产物提取法等。使用化学合成和天然提取法产物收率效益较低并且会造成较大的污染,因此本论文旨在完善全酶法合成唾液酸糖苷类化合物的途径。在全酶法合成唾液酸糖苷类化合物的通路中,有关N-乙酰葡萄糖胺的N-乙酰基转移反应的研究报道很少,由于该过程需利用羟基作为保护基团且反应所需条件极为苛刻,一直以来都是相关研究的难点。本论文以本实验室从Cyclobacteriummarinum中发现并克隆表达得到的CmCBDA脱乙酰基酶为关键工具酶,完成了葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺在37℃无保护基团的条件下的N-乙酰化和N-转乙酰化反应。实验首次以N-乙酰葡萄糖胺和有机酸为底物,一锅法催化合成了X-gal-N-乙酰神经氨酸、X-gal-N-丙酰神经氨酸和X-gal-N-羟乙酰神经氨酸,并采用高效液相色谱-质谱联用及核磁共振等检测方法对产物进行了分析,结果证明该全酶法合成唾液酸糖苷类化合物途径具有转化率高、提取简单、产品纯度高等优点。

关键词：唾液酸糖苷类化合物全酶法合成产物收率检测方法

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Akkermansia muciniphila源唾液酸糖苷酶基因的克隆表达与酶学特性研究

Akkermansia muciniphila源唾液酸糖苷酶基因的克隆表达与酶学特...

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作者：黄坤南京农业大学

学位级别：硕士

唾液酸又称为神经氨酸,是一类广泛分布于生物体中的九碳单糖酸。在自然界中,通常以α 2,3或α 2,6糖苷键连接在半乳糖上,α 2,6糖苷键连接在N-乙酰半乳糖胺上和α 2,8糖苷键连接在其它唾液酸上。唾液酸糖苷酶是一类能够识别并水解糖复... 详细信息

唾液酸又称为神经氨酸,是一类广泛分布于生物体中的九碳单糖酸。在自然界中,通常以α 2,3或α 2,6糖苷键连接在半乳糖上,α 2,6糖苷键连接在N-乙酰半乳糖胺上和α 2,8糖苷键连接在其它唾液酸上。唾液酸糖苷酶是一类能够识别并水解糖复合物非还原末端唾液酸残基的α外切糖苷水解酶,是糖链结构分析中的重要工具酶。Akkermansia muciniphila是一种新发现的人体肠道益生菌,革兰氏阴性,严格厌氧,能够水解粘蛋白上的寡糖链来为其自身的生长繁殖提供碳源、氮源和能源。Akkermansia muciniphila的全基因组测序已经完成,通过生物信息学手段分析发现,在该菌的全基因组中含有编码唾液酸糖苷酶基因的序列,而在以前的研究当中,亦有关于该菌能够表达唾液酸糖苷酶的报道。本研究在上述信息基础上,拟从Akkermansia muciniphila中挖掘新的唾液酸糖苷酶。首先通过分子生物学技术,本研究成功的从Akkermansia muciniphila中克隆得到4种唾液酸糖苷酶基因,分别为Am0705、Am0707、Am1757和Am2085,并在β半乳糖糖苷酶基因被敲除的*** BL21(DE3)细胞中进行了异源重组表达,通过Nickel-NTA 一步纯化得到单一条带的蛋白质。合适的底物是酶活性检测和酶学特性研究的基础。为了更好的模拟自然界中唾液酸在复合物中的存在形式,本研究利用文献报道的源自美人鱼发光杆菌(Photobacserium damesl)的唾液酸糖基转移酶PdST6、源自空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的唾液酸糖基转移酶CjST8、源自脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的CMP-Sia合成酶NmCTT和源自发酵成对杆菌(Dyadobbacter fementans)的唾液酸醛缩酶DfNeuLy,以X-Gal作为唾液酸糖基受体,通过一锅多酶法和C18固相萃取柱成功的合成并纯化得到8种不同的唾液酸糖苷类化合物,分别为 X-Gal α 2,3 Neu5Ac、X-Gal α 2,6 Neu5Ac、X-Gal α 2,3 Neu5Gc、X-Gal α 2,6 Neu5Gc、X-Gal α 2,3 KDN、X-Gal α 2,6 KDN、X-Gal α 2,3 Neu5Prop 和 X-Gal α 2,6 Neu5Prop。该唾液酸糖苷类化合物比通常所用的底物如pNP-Sia更接近唾液酸的自然存在形式,因此结果具有更高的可信度。以X-Gal α 2,3 Neu5Ac和X-Gal α 2,6 Neu5Ac为底物检测重组酶活性,结果表明,4种重组酶都具有酶活性。以上述合成的8种唾液酸糖苷类化合物作为底物研究4种重组唾液酸糖苷酶的底物特异性,结果表明,4种重组酶都能够水解α 2,3和α 2,6唾液酸糖苷键,而且对X-Gal α 2,3 Neu5Ac 的水解活性最好,然而对 X-Gal α 2,3 KDN 和 X-Gal α 2,6 KDN的水解能力最弱,因此,以X-Gal α 2,3 Neu5Ac为底物,进一步研究4种重组唾液酸糖苷酶的酶学特性。研究表明,Am0705、Am0707、Am1757和Am2085的最适pH分别为8.0、6.0、7.5和7.0。最适温度分别为42℃、42℃、37℃和37℃。Am0705、Am0707、Am1757 和Am2085 的Km值分别为106μmol/L、80μmol/L、121 μmol/L 和 101 μmol/L,Vmax 分别为 50.6 μmol/min、6.6 μmol/min、27.5μmol/min 和 10.4 μmol/min。EDTA 能够完全抑制 Am0705、Am0707、Am1757 和Am2085的活性,然而Am0707却能够保持57.9%的活性;Cu2+和Zn2+能够完全抑制4种酶的酶活性;Fe2+显著提高Am0705的酶活性至179.9%,然而却完全抑制Am2085的酶活性;Fe3+显著提高Am2085的酶活性至145.1%。本研究成功的从人体肠道共生菌Akkermansia muciniphila中克隆得到4种唾液酸糖苷酶同工酶基因。同时以X-Gal作为唾液酸糖基受体,采用一锅多酶法成功合成更好模拟唾液酸自然存在形式的8种唾液酸糖苷类化合物。以该化合物为底物研究4种重组酶的底物特异性,结果表明,4种同工酶具有广泛的底物识别范围,不仅能够水解α 2,3和α 2,6连接的唾液酸,而且还能水解不同结构的唾液酸。因此,本研究结果为含唾液酸寡糖链结构分析提供4种可能的工具酶。此外,利用包括4种酶在内的"一锅多酶法"成功合成了以X-Gal为唾液酸糖基受体的8种唾液酸糖苷类化合物,为唾液酸糖苷酶研究提供更为可靠的底物。

关键词：唾液酸糖苷酶 Akkermansiamuciniphila 酶学特性唾液酸糖苷类化合物

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禽类唾液酸醛缩酶的酶学特性及其在KDN类物质合成中的应用

禽类唾液酸醛缩酶的酶学特性及其在KDN类物质合成中的应用

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作者：齐晓晗南京农业大学

学位级别：硕士

唾液酸是许多生物体内糖蛋白和糖脂的重要组成成分,对于相关蛋白和脂质功能的调节有着重要的意义,因此唾液酸的合成成为近些年来研究的热点。合成唾液酸的方式有很多,其中天然提取法和化学合成法制备产率较低,反应条件较为苛刻且易产生... 详细信息

唾液酸是许多生物体内糖蛋白和糖脂的重要组成成分,对于相关蛋白和脂质功能的调节有着重要的意义,因此唾液酸的合成成为近些年来研究的热点。合成唾液酸的方式有很多,其中天然提取法和化学合成法制备产率较低,反应条件较为苛刻且易产生有毒物质。相比之下,酶法合成可以简便高效的获取满足生产需求的唾液酸。唾液酸醛缩酶是合成途径中非常关键的酶,但通常较为昂贵;此外,禽类制品中唾液酸含量较高,是其最丰富的天然来源之一,且禽类唾液酸循环与病毒的流行有着重要的关联。因此探究新型禽类来源的唾液酸醛缩酶并将其应用于唾液酸类物质的合成具有重要的意义。本论文通过NCBI基因文库成功地挖掘到Anas platyrhynchos(绿头鸭)、Columba livia(岩鸽)、Gallus(鸡)三种禽类来源编码唾液酸醛缩酶的基因序列,基因合成后成功地经大肠杆菌表达细胞BL21(DE3)进行表达、亲和层析纯化,对酶活进行检测并探究它们的活性位点,以及对三种唾液酸醛缩酶的酶学特性进行探究并催化合成了唾液酸类似物。本研究首次探究禽类来源的唾液酸醛缩酶,获得了更易于表达、纯度较高以及活性较强的唾液酸醛缩酶并合成了KDN类物质。1.唾液酸醛缩酶活性测定和活性位点的研究通过SDS-PAGE电泳结果可知三种唾液酸醛缩酶均可以成功地经大肠杆菌表达细胞BL21(DE3)诱导表达并用Ni-NTA实现亲和层析纯化。利用薄层色谱层析后的显色反应对酶活性进行检测,得出结论:三种唾液酸醛缩酶都可以在分解反应方向催化生成相应的单糖,且根据TLC板上条带的颜色可以得出Ap NPL的活性在三种酶中最强;但是合成方向较低浓度底物不易发生相应的酶促反应。随后,为了进一步探究三种唾液酸醛缩酶的活性位点,通过与来源于大肠杆菌的唾液酸醛缩酶Ec NPL对比,将第172位的赖氨酸成功地突变为丙氨酸,并提高合成反应方向的底物浓度以同样的方式进行测活,探究影响三种NPL的关键活性位点。通过SDS-PAGE电泳结果可以得出结论:三种突变后的唾液酸醛缩酶仍可以成功地经大肠杆菌表达细胞BL21(DE3)诱导表达并能实现亲和层析纯化;由测活结果可知:突变后的唾液酸醛缩酶在分解反应方向均有一定的活性,但是在合成反应方向,突变后的酶对不同底物均不具有活性,这进一步验证了三种唾液酸醛缩酶的第172位的赖氨酸是它们的关键活性位点,可以明显影响其催化反应的活性。2.禽类唾液酸醛缩酶的酶学特性探究及其在KDN类物质合成中的应用为了进一步探究三种禽类来源的唾液酸醛缩酶最基本的生化特性,以Neu5Ac为底物进行酶促反应,探究三种唾液酸醛缩酶基本的酶学特性:最适反应温度、p H及金属离子的影响,反应后根据酶标仪读数作图可以得出结论:三种唾液酸醛缩酶的最适反应温度条件为42°C;Ap NPL和Cl NPL的最适反应p H为6,而Gg NPL的最适反应p H为7.5;三种酶的活性均不依赖于金属离子,但是Mg可以最大程度地提高酶的活性,而Fe和Mn相较于其它金属离子会较大程度地抑制Cl NPL和Gg NPL的活性。KDN作为一种不寻常的唾液酸,可以作为一种癌胎抗原和新型的神经氨酸酶抑制剂等应用于疾病的预防和治疗,且本实验探究的禽类来源的唾液酸醛缩酶可以合成KDN类物质。因此通过提高底物浓度选取了其中活性最强的Ap NPL催化合成了KDN类物质,并用HPLC和MALDI-TOF-MS对产物进行检测。最后通过计算得由甘露糖合成得到的KDN产率为42.4%;由半乳糖合成的5’EPI-KDN产率为12.6%。

关键词：唾液酸唾液酸醛缩酶唾液酸糖苷类化合物薄层色谱层析

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