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溃疡性结肠炎患者唾液外泌体内蛋白标志物筛选及功能分析

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北京大学学报(医学版) 2024年

作者：杨丛艺郑小雯陈静宜徐俊陈峰陈扬陈宁北京大学基础医学院精准医疗多组学研究中心北京大学人民医院消化内科北京大学口腔医院中心实验室

目的：筛选可能与溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)密切相关的蛋白标志物，探索UC患者唾液外泌体特异性高表达蛋白的功能及在UC发病中的作用。方法：从北京大学人民医院消化内科共招募初诊初治活动期UC患者37例，健康对照(healthy ... 详细信息

目的：筛选可能与溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)密切相关的蛋白标志物，探索UC患者唾液外泌体特异性高表达蛋白的功能及在UC发病中的作用。方法：从北京大学人民医院消化内科共招募初诊初治活动期UC患者37例，健康对照(healthy control，HC) 志愿者10人，收集全部受试者唾液后分别提取唾液外泌体，用于Shotgun质谱分析及后续实验，找出UC组和HC组之间差异表达的蛋白质。利用DAVID工具对差异表达蛋白的基因进行GO(gene ontology)、KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析。体外实验将UC组与HC组唾液外泌体分别与巨噬细胞共培养，实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR ，qPCR)检测细胞CD80＋、CD86＋水平；ELISA法检测细胞上清白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)分泌水平。结果：UC组与健康对照组唾液外泌体中共表达的蛋白质259种，其中有11种蛋白质在UC组中高表达，包括PDIA4、A2M、EEF2、C3、PSMA2、PSMB6、PSMA1、IGHG1、IGHG3、IGHG4、SERPING1，4种蛋白质在UC组中低表达，包括TCN1、SLPI、CTSZ、TFF3，将这15种蛋白质与仅存在于UC患者中的129种特异蛋白质，以及仅存在于健康对照组中的69种特异蛋白质共同进行GO/KEGG功能学分析，发现UC组唾液外泌体中蛋白酶体相关蛋白PSMA1，PSMA2，PSMB6表达升高以及补体级联通路中多种关键分子如C3等表达上调。体外共培养实验发现，与健康对照组相比，活动期UC患者唾液外泌体可以通过促进巨噬细胞向M1型转化并分泌炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α从而发挥促炎作用。结论：UC患者唾液外泌体可能具有促进炎症的功能，对UC患者及健康对照唾液外泌体内蛋白质进行分析，发现在两组共表达的蛋白质中有15种蛋白质表达量存在明显差异，其中UC组高表达的C3、PSMA2、PSMB6、PSMA1主要与免疫及炎症反应相关，提示UC患者唾液外泌体中特异性高表达的蛋白质有作为UC诊断疾病标志物的潜力，并可能在UC的发病中发挥作用。

关键词：溃疡性结肠炎唾液外泌体生物标志物肠道免疫

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唾液外泌体与口腔疾病相关研究进展

口腔疾病防治 2022年第4期30卷 300-304页

作者：孙岩程磊彭显口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙体牙髓科四川成都610041 口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院四川成都610041

唾液外泌体是指存在于唾液中的直径在30~150 nm的细胞外囊泡。随着近年来技术手段的发展,大量研究揭示唾液外泌体在多种口腔疾病的发生发展中发挥重要作用,如唾液外泌体CD9及CD81通过调控细胞粘附及运动促进肿瘤细胞转移、唾液外泌体miR... 详细信息

唾液外泌体是指存在于唾液中的直径在30~150 nm的细胞外囊泡。随着近年来技术手段的发展,大量研究揭示唾液外泌体在多种口腔疾病的发生发展中发挥重要作用,如唾液外泌体CD9及CD81通过调控细胞粘附及运动促进肿瘤细胞转移、唾液外泌体miR⁃24⁃3p通过作用于PER1促进肿瘤细胞增殖、唾液外泌体程序性细胞死亡配体⁃1(programmed cell death⁃ligand 1,PD⁃L1)mRNA抑制炎症组织的破坏等,具有作为诊断口腔癌、牙周炎等口腔疾病的生物标志物的潜能。因此,唾液外泌体可作为口腔疾病潜在的预后和诊断标志物。唾液外泌体除与口腔疾病,如口腔癌、牙周炎、口腔扁平苔藓、干燥综合征等有关外,还同远处部位肿瘤如胰腺癌、肺癌等及系统性疾病如帕金森综合征、炎症性肠病等密切相关;深入研究唾液外泌体对口腔、全身系统性疾病的诊断与治疗作用,开发唾液外泌体作为疾病诊断的生物标志物的潜力具有重要意义。

关键词：细胞外囊泡唾液外泌体生物标志物口腔疾病口腔癌牙周炎肿瘤系统性疾病

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人唾液外泌体对皮肤损伤的修复作用及其机制研究

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人唾液外泌体对皮肤损伤的修复作用及其机制研究

作者：宋思嘉广西医科大学

学位级别：硕士

目的和意义:皮肤受到累及真皮深层的创伤后,往往形成瘢痕性愈合。成纤维细胞是创面组织修复的主要功能细胞,成纤维细胞的性能与伤口的愈合密切相关。研究表明,多种来源的外泌体能够促进损伤修复,减轻纤维化。而唾液有促进伤口愈合、减... 详细信息

目的和意义:皮肤受到累及真皮深层的创伤后,往往形成瘢痕性愈合。成纤维细胞是创面组织修复的主要功能细胞,成纤维细胞的性能与伤口的愈合密切相关。研究表明,多种来源的外泌体能够促进损伤修复,减轻纤维化。而唾液有促进伤口愈合、减少瘢痕形成的作用,具体机制尚未明确,唾液中富含外泌体,因此,本研究拟探讨人唾液外泌体(saliva-derived exosomes,S-Exos)对人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblasts,HSFs)增殖、迁移、肌成纤维细胞活化和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)分泌等特性的效应,并通过体内实验探索唾液外泌体对大鼠皮肤损伤修复的影响。通过体内、体外研究,阐明唾液外泌体在皮肤损伤修复过程中所发挥的生物学效应,并通过生物信息学分析,筛选唾液及唾液外泌体中的差异基因,选出富集最显著的通路,深入探讨其可能的作用机制。通过上述研究,期望能为皮肤瘢痕组织的防治研究提供新的实验资料,为唾液外泌体的临床应用提供实验依据和理论支持。方法:1.S-Exos的分离、提取及鉴定:收集健康成年人非刺激性全唾液,用PBS稀释后采用差速离心、超高速离心法和超滤法相结合提取S-Exos,BCA测定蛋白浓度,透射电镜观察S-Exos形态,Western blot检测外泌体标志性蛋白。2.体外评价唾液及S-Exos对HSFs特性的影响:组织块贴壁法分离培养HSFs。分别用唾液和S-Exos与HSFs共培养,通过CCK-8细胞增殖实验、Transwell实验和实时荧光定量聚合酶链反应(Real time polymerase chain reaction,RT-q PCR)来评价唾液和S-Exos对HSFs特性的影响。3.S-Exos影响HSFs特性的机制研究:1)通过GEO数据库分析唾液和唾液外泌体差异表达基因(DEGs)。随后,利用KOBAS 3.0平台对S-Exos中上调的DEGs进行KEGG功能富集分析,富集的通路中,“PI3K/Akt信号通路”为富集最显著的通路。2)HSFs用S-Exos以不同的时间梯度处理,Western Blot检测处理后PI3K/Akt信号通路的激活情况;4.体内探究S-Exos对大鼠皮肤损伤修复的影响及机制:选取30只6–8周龄雄性SD大鼠随机分为5组(对照组,saliva组,S-Exos组,S-Exos+LY294002组,LY294002组)。各组大鼠建立全厚皮肤缺损模型,术后48h,根据分组在创缘附近四个部位皮下注射不同的注射液100μL(每点25μL)。在术后第0、4、8、12、14天观察并拍照记录各组大鼠创面愈合情况,计算伤口愈合率。于术后第14和第35天处死大鼠,取创面皮肤组织,采用HE染色观察皮肤组织形态表现。5.体外探究S-Exos通过PI3K/Akt通路对HSFs特性的影响:在S-Exos与HSFs细胞的共培养体系中加入PI3K抑制剂LY294002,通过CCK-8细胞增殖实验、RT-q PCR和Western Blot来检测S-Exos是否通过PI3K/Akt信号通路影响HSFs的特性及瘢痕相关因子的形成。结果:1.健康成年人唾液中可分离提取出S-Exos:唾液可分离提取出S-Exos。用透射电镜观察S-Exos,其具有双层膜结构,呈杯状,直径约70 nm;Western blot结果显示,S-Exos表达生物标志物CD9和CD63。2.S-Exos能够调节HSFs的特性:1)用组织块贴壁法从皮肤组织中成功分离培养出HSFs,细胞贴壁生长,呈纺锤形或梭形;2)唾液和S-Exos能促进HSFs的增殖,且S-Exos对HSFs增殖的促进作用比Saliva更稳定;3)Transwell实验结果显示,S-Exos对HSFs的迁移有抑制作用;4)RT-q PCR结果显示,与对照组相比,Saliva组和S-Exos组的HSFs中I型、III型胶原和α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)等瘢痕相关因子的m RNA合成减少,有助于抑制瘢痕形成的转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3)因子的m RNA合成增加。3.S-Exos能够通过激活PI3K/Akt信号通路:1)通过生物信息学方法,对唾液和唾液外泌体差异表达基因(DEGs)进行KEGG功能富集分析,选出PI3K/Akt通路;2)S-Exos与HSFs共培养0–120 min,随着时间增加,Western blot检测出P-Akt的表达明显增强,PI3K/Akt信号通路被激活。4.S-Exos能够通过PI3K/Akt信号通路促进大鼠皮肤损伤修复并减轻瘢痕形成:动物实验表明,S-Exos可以促进大鼠皮肤伤口面积

关键词：唾液外泌体皮肤成纤维细胞损伤修复瘢痕形成

纳升液相色谱-高分辨串联质谱研究不同分离方法对唾液外泌体蛋白质组的影响

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分析化学 2018年第9期46卷 1408-1414页

作者：曾琼兰吴利李水明王勇深圳大学生命科学学院深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室深圳大学生命科学学院深圳市微生物基因工程重点实验室

外泌体是一系列胞外囊泡,是生物标志物的来源,但目前尚无灵敏高效的唾液外泌体蛋白质分离方法。本研究采用质谱方法比较唾液外泌体试剂盒(Exo Quick,EQ)方法和超高速离心(Ultracentrifugation,UC)方法分离外泌体的效果以及尿素缓冲液、R... 详细信息

外泌体是一系列胞外囊泡,是生物标志物的来源,但目前尚无灵敏高效的唾液外泌体蛋白质分离方法。本研究采用质谱方法比较唾液外泌体试剂盒(Exo Quick,EQ)方法和超高速离心(Ultracentrifugation,UC)方法分离外泌体的效果以及尿素缓冲液、RIPA裂解液、SDS裂解液提取外泌体蛋白质的效果。Brodford法和BCA定量测定结果表明,EQ方法分离0.5 m L唾液外泌体得到的蛋白质含量高于UC方法分离2 m L唾液所得到的蛋白质。进一步的质谱分析表明,前者鉴定到的蛋白质数目亦多于后者;试剂盒分离唾液外泌体与尿素缓冲液提取外泌体蛋白质的方法联用效果最佳,鉴定到194种蛋白质。本方法重现性好、样品用量少、检测结果稳定,可为在唾液外泌体中筛选疾病的标志物提供方法学参考。

关键词：纳升液相色谱-高分辨串联质谱唾液外泌体外泌体试剂盒超高速离心法

基于唾液基因组学探讨慢性胃炎和胃癌脾虚证的分子机制研究

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基于唾液基因组学探讨慢性胃炎和胃癌脾虚证的分子机制研究

基于外泌体RNA探讨四君子汤治疗胃癌脾胃气虚证的分子机制

中国中西医结合学会诊断专业委员会第十三次全国学术研讨会

作者：雷慧珺曹建中李丰湖南中医药大学 School of Dentistry University of CaliforniaLos Angeles CA

中医证候研究是中医药学的研究热点,基于唾液基因组学探讨证候复杂性并揭示其科学内涵具有巨大潜力。文章通过分析慢性胃炎和胃癌脾虚证的联系以及疾病的进展过程,运用唾液基因组学的学科优势,基于唾液外泌体exoRNA表达谱,在中医学同病... 详细信息

中医证候研究是中医药学的研究热点,基于唾液基因组学探讨证候复杂性并揭示其科学内涵具有巨大潜力。文章通过分析慢性胃炎和胃癌脾虚证的联系以及疾病的进展过程,运用唾液基因组学的学科优势,基于唾液外泌体exoRNA表达谱,在中医学同病异证,异病同证的理论指导下,提出寻找其具有临床价值的差异表达的分子标志物,推动证候物质基础的定量、定性研究,从分子机制角度进一步促进中医肿瘤证候的精准化发展。

关键词：唾液基因组学唾液外泌体中医证候同病异证异病同证差异分子标志物精准化

来源： cnki会议评论

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基于外泌体RNA探讨四君子汤治疗胃癌脾胃气虚证的分子机制

作者：雷慧珺湖南中医药大学

学位级别：硕士

目的:探寻外泌体RNA在胃癌脾虚证血浆和唾液中的表达差异,探索建立胃癌的早期诊断和脾虚证候辨识的无创伤检测新方法,通过考察胃癌细胞外泌体RNA在四君子汤治疗胃癌脾虚证候过程中的变化探索四君子汤治疗胃癌脾虚证的可能的分子机制。方... 详细信息

目的:探寻外泌体RNA在胃癌脾虚证血浆和唾液中的表达差异,探索建立胃癌的早期诊断和脾虚证候辨识的无创伤检测新方法,通过考察胃癌细胞外泌体RNA在四君子汤治疗胃癌脾虚证候过程中的变化探索四君子汤治疗胃癌脾虚证的可能的分子机制。方法:通过苦寒泄下和饥饱失常复合造模法构建裸鼠脾虚证候模型。将人源胃癌细胞株NCI-N87接种到裸鼠腋下,培育胃癌组织块,剥取皮下组织块并移植到裸鼠脾虚证候模型,建立胃癌脾虚证原位移植鼠动物模型。将造模裸鼠随机分为模型组,中药组。中药组术后常规喂养,同时给予四君子汤1次/d灌胃2w,其余二组等量生理盐水灌胃。定期监测裸鼠造模期体重、饮水量、进食量变化,以及中医宏观表征赋值评分;定期监测术后裸鼠体重变化以及肿瘤转移情况,实验第22d,24d二次收集唾液,实验结束后摘眼球采血,离心获得血浆,剥取瘤体,统计瘤重及抑瘤率。分别进行血浆和唾液的exo RNA分离纯化,构建c DNA文库并进行RNAseq分析;运用生物信息学、生物统计学分析筛选差异表达的exo RNA。结果:（1）胃癌脾虚证原位移植鼠动物模型构建实验结果（1）脾虚证型造模后,肉眼观察模型裸鼠精神萎靡,有倦缩扎堆,眯眼弓背等反应,消瘦,便形质软甚者溏稀。裸鼠进食量、饮水量、体质量与正常组比较,明显下降（P＜0.01）;模型裸鼠中医宏观表征观察评分均在5分以上,与正常组比较,分值明显升高（P＜0.01）。（2）在脾虚证型构建基础上行胃癌原位移植术,胃癌脾虚证裸鼠模型构建成功。（2）基于外泌体（exo RNA）探讨四君子汤治疗胃癌脾虚证的分子机制实验结果（1）与对照组相比,模型组、SJZD组在实验12d、15d、18d、21d、24d体重较对照组均明显降低（P＜0.01）;SJZD组在给予SJZD治疗后,在18d、21d、24d体重较模型组明显增长（P＜0.01）,且裸鼠整体状态较前活跃,眯眼弓背和扎堆反应渐少,大便软硬适中;与模型组相比,SJZD组较其瘤重明显降低（P＜0.01）。（2）分析差异血浆miRNA表达发现,对比人源基因组序列,miR-328-3p（Log2（FC）=-2.637）、miR-339-5p（Log2（FC）=-2.338）,在模型组中相对对照组表达上调,用药后表达下降;miR-1-3p（Log2（FC）=1.450）、miR-151a-3p（Log2（FC）=3.267）、miR-184（Log2（FC）=1.880）、miR-202-5p（Log2（FC）=2.511）、miR-34c-5p（Log2（FC）=2.960）,在模型组中相对对照组表达下降,用药后表达上调。对比鼠源基因组序列,miR-328-3p（Log2（FC）=-2.595）、miR-339-5p（Log2（FC）=-2.274）,在模型组中相对对照组表达上调,用药后表达下降;miR-184-3p（Log2（FC）=1.929）、miR-1a-3p（Log2（FC）=1.507）、miR-202-5p（Log2（FC）=2.563）、miR-3470a（Log2（FC）=3.001）、miR-3470b（Log2（FC）=3.609）、miR-34c-5p（Log2（FC）=3.015）、miR-466i-5p（Log2（FC）=4.990）,在模型组中相对对照组表达下降,用药后表达上调。（3）分析差异唾液miRNA表达发现,对比人源基因组序列,miR-184在模型组中相对对照组高表达,用药后表达下降;miR-151a-3p在模型组中相对对照组低表达,用药后表达上调。对比鼠源基因组序列,未发现明显表达差异基因。（4）对比模型组和对照组,交互唾液人源差异miRNA与血浆人源差异miRNA发现,miR-145-3p、miR-1-3p、miR-3615、miR-151a-3p、miR-142-3p、miR-184、miR-126-3p、miR-28-5p、miR-500a-3p、miR-7-5p、miR-320a-3p这11个血浆样本中人源特有差异miRNA在唾液外泌体中也存在。即胃癌细胞分泌的外泌体经过体液循环到达唾液腺,通过与唾液腺细胞的融和和內吞作用被唾液腺细胞吸收并最终释放进入唾液。结论:1.四君子汤可能通过作用于血浆和唾液人源共有差异靶基因miR-151a-3p调控参与胃癌脾虚证的发生、发展,发挥健脾益气效应。***-145-3p、miR-1-3p、miR-3615、miR-151a-3p、miR-142-3p、miR-184、miR-126-3p、miR-28-5p、miR-500a-3p、miR-7-5p、miR-320a-3p这11个血浆样本中人源特有差异miRNA在唾液外泌体中也存在,唾液诊断有望成为胃癌的早期诊断和脾虚证候辨识的无创伤检测新方法。

关键词：血浆外泌体唾液外泌体中医证候差异分子标志物中医诊断脾虚证

基于唾液转录组学探讨慢性胃炎和胃癌脾虚证的分子机制

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世界中医药 2021年第14期16卷 2196-2199页

作者：雷慧珺曹建中李亮谢梦洲付越李丰湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室长沙410208 加州大学洛杉矶分校牙医学院洛杉矶90095

中医证候研究是中医药学的研究热点,基于唾液转录组学探讨疾病证候的复杂性并揭示其科学内涵具有巨大科研潜力。现分析了慢性胃炎和胃癌脾虚证的联系以及疾病的进展过程。基于唾液外泌体exoRNA表达谱,运用唾液转录组学的学科优势,在中... 详细信息

中医证候研究是中医药学的研究热点,基于唾液转录组学探讨疾病证候的复杂性并揭示其科学内涵具有巨大科研潜力。现分析了慢性胃炎和胃癌脾虚证的联系以及疾病的进展过程。基于唾液外泌体exoRNA表达谱,运用唾液转录组学的学科优势,在中医学同病异证,异病同证的理论指导下,提出寻找其具有临床价值的差异表达的分子标志物。进一步推动证候物质基础的定量、定性研究,并从分子机制角度切入促进中医肿瘤证候的精准化发展。

关键词：唾液转录组学唾液外泌体中医证候同病异证异病同证差异分子标志物精准化

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