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作者：任国梅山西医科大学

学位级别：硕士

目的:通过观察间歇低氧前提下SD大鼠肝脏细胞形态学变化并测定SD大鼠肝脏细胞中两个指标即糖原合成酶激酶-3(GSK-3)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白1(m TOR1)的表达水平,探讨间歇低氧对SD大鼠肝脏细胞胰岛素信号转导通路的影响及其产生胰岛素... 详细信息

目的:通过观察间歇低氧前提下SD大鼠肝脏细胞形态学变化并测定SD大鼠肝脏细胞中两个指标即糖原合成酶激酶-3(GSK-3)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白1(m TOR1)的表达水平,探讨间歇低氧对SD大鼠肝脏细胞胰岛素信号转导通路的影响及其产生胰岛素抵抗(IR)的可能机制。方法:按照随机数字表法选取24只6周龄的健康雄性SD大鼠等分为3组,即间歇空气对照组(NC组)、间歇低氧(又称间歇性缺氧)4周组(IH4组)及8周组(IH8组)。将IH4组及IH8组于每日9时至17时(共8小时)置于间歇低氧舱内的间歇低氧环境中,同时NC组则给予间歇压缩空气。IH4组于第4周,NC组、IH8组于第8周实验结束后禁食12小时,检测各组大鼠的空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)水平,并采用FBG、FINS计算胰岛素敏感性指数(ISI)和稳态模型评估-胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)评价IR;对SD大鼠肝脏组织苏木素-伊红(HE)染色观察各组肝脏细胞形态学变化,评价间歇低氧对大鼠肝脏细胞的损伤程度;免疫组织化学方法检测大鼠肝脏细胞中GSK-3、m TOR1的表达,以平均灰度值表示两指标的蛋白表达量,统计学分析数据。结果:相比对照组,IH4组与IH8组大鼠的FBG、FINS、HOMA-IR升高,ISI降低,以IH8组更为显著,差异均有统计学意义(F值分别为100.375,69.90,85.49,62.52,P均蛋白表达均升高,且以IH8组更明显,差异均有统计学意义(F值分别为72.25,148.01,P均蛋白表达上调,表达量与间歇低氧时间正相关。3.间歇低氧SD大鼠肝脏细胞内GSK-3、m TOR1蛋白表达与HOMA-IR、ISI明显相关,提示这两指标可能参与了间歇低氧所致的胰岛素抵抗的发生、发展。

关键词：间歇低氧胰岛素抵抗糖原合成酶激酶-3 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白1

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树突状细胞的TSC1对抗原非特异性初始T细胞活化和增殖的作用机制

树突状细胞的TSC1对抗原非特异性初始T细胞活化和增殖的作用机制

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作者：杨菲北京协和医学院

学位级别：硕士

背景:树突状细胞(dendritic cells,DCs)是一种诱导T细胞活化和增殖反应的重要细胞。结节性硬化物1(tuberous sclerosis complex 1,Tsc1)是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)上游重要的负调节因子。最近的研... 详细信息

背景:树突状细胞(dendritic cells,DCs)是一种诱导T细胞活化和增殖反应的重要细胞。结节性硬化物1(tuberous sclerosis complex 1,Tsc1)是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)上游重要的负调节因子。最近的研究突出Tsc1在树突状细胞的发育方面的作用,但是在体内Tsc1是否直接调节或者怎么调节成熟树突状细胞对T细胞活化增殖作用的机制还不是很明晰。目的:本实验主要研究稳态下成熟树突状细胞表达的Tsc1对T细胞活化增殖作用的机制。方法:(1)Tsc1f/f小鼠和CD11cCre转基因小鼠杂交来建立特异性敲除树突状细胞中Tsc1的小鼠(CD11cCreTsc1f/f)系统,普通PCR和westernblot分别在基因水平和蛋白水平检测Tsc1基因是否敲除。(2)流式细胞术检测T细胞的活化、Ki67表达和细胞因子的表达。(3)应用体外树突状细胞-初始T细胞共培养系统,流式细胞术检测阻断或不阻断Nrp1时T细胞增殖;流式细胞术检测树突状细胞中Nrp1的表达。(4)流式细胞仪检测树突状细胞主要信号通路的激活和变化;流式细胞术检测树突状细胞胞内S6K磷酸化水平、Nrp1表达水平和T细胞的活化比例。结果:(1)成功建立了Tsc 基因敲除小鼠,Tsc1在基因水平和蛋白水平均被敲除。(2)Tc1基因敲除后与对照组相比,脾脏CD4+T细胞和CD8+T细胞活化增加,脾脏中初始CD4+T细胞和CD8+T细胞的细胞数随年龄增加而减少,T细胞细胞增殖增加和细胞因子表达升高。(3)Tc1基因敲除后与对照组相比,树突状细胞诱导的初始T细胞增殖是增加的,树突状细胞中表达大量的Nrp1,阻断Nrp1,可以部分抑制由Tsc1敲除的树突状细胞启动的初始CD4+T细胞的活化。(4)Tc1基因敲除后与对照组相比,S6K和PPAR-y的活化明显增加;在CD11cCreTsc1f/f Raptorf/+小鼠树突状细胞中Nrp1表达及T细胞活化的表型被极大地挽救,mTORC1的过度表达被降低;抑制PPAR-γ,可以使Tsc1敲除的树突状细胞中Nrp1的表达降低。结论:(1)成功建立了Tsc 基因敲除小鼠CD11cCreTsc1f/f;(2)树突状细胞的Tsc1基因可以防止体内自发的T细胞活化;(3)在树突状细胞中Tsc1通过抑制Nrp1表达来阻止初始T细胞的增殖;(4)Tsc1通过阻止mTORC1-PPAR-γ信号通路来抑制Nrp1的表达。目的探索转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)通过调节树突状细胞(dendriticcells,DCs)的功能从而抑制CD4+T细胞增殖活化的可能作用机制。方法应用CD11c+免疫磁珠分选小鼠脾脏DCs,并检测其纯度。TGF-β处理DCs后,进行基因芯片检测。实时定量PCR验证基因芯片结果。DCs经TGF-β处理后和CD4+T细胞共培养,流式细胞术检测CD4+T细胞的活化和增殖。结果CD11c磁珠分选DCs纯度可以达到95%。TGF-β处理DCs后,抑制DCs表面CD53、CD69、CD33、CD74、CD93 分子的表达;抑制趋化因子 Cc13、Ccl5、Ccl9、Cc16、Cc117、Cxcl10、Cc122、Cc14、Ccr7、Cc12、Cxc19、Ccr7 的表达;抑制 IL-2ra、IL12-rb2、IL-15ra、IL-1b、IL-15炎性细胞因子及其受体的表达;抑制CD4+T细胞的增殖和活化。结论TGF-β可以抑制DCs部分重要的表面CD分子、趋化因子及其受体、细胞因子及其受体的表达,最终抑制CD4+T细胞的促活化和增殖。

关键词：树突状细胞结节硬化复合物1 Nrp1 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白1 树突状细胞基因芯片转化生长因子β CD4+T细胞

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mTORC1抑制剂增强KRAS突变型肺癌细胞对化疗药物敏感性药效及机制研究

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中国药师 2020年第2期23卷 237-241页

作者：宋映容王洁王羽超南京医科大学附属脑科医院药学部南京210029 南京医科大学附属脑科医院呼吸科南京210029

目的:探讨Kirsten大鼠肉瘤病毒基因同源物(KRAS)突变型肺癌细胞对化疗药物敏感性降低的机制及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白1(m TORC1)抑制剂增强KRAS突变型肺癌细胞对化疗药物敏感性药效及机制。方法:选取在本院就诊并确诊为KRAS突变型非小... 详细信息

目的:探讨Kirsten大鼠肉瘤病毒基因同源物(KRAS)突变型肺癌细胞对化疗药物敏感性降低的机制及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白1(m TORC1)抑制剂增强KRAS突变型肺癌细胞对化疗药物敏感性药效及机制。方法:选取在本院就诊并确诊为KRAS突变型非小细胞肺癌的患者53例,通过Q-PCR及Western blot检测患者肿瘤病变部位m RNA及蛋白水平m TORC1相关因子的表达,对比产生耐药及未产生耐药患者体内以上因子的差异。构建KRAS突变型肺癌细胞,采用MTT及Western blot检测不同浓度m TORC1抑制剂或m TORC1抑制剂与顺铂联合使用对KRAS突变型肺癌细胞的抑制增殖、m TORC1活性底物S6K和4EBP1的磷酸化(p)水平的作用。结果:与未耐药KRAS突变型肺癌患者相比,耐药患者体内m RNA及蛋白水平m TORC1相关因子的表达均显著上升(P<0.05);低浓度m TORC1抑制剂即可对KRAS突变型肺癌细胞有明显抑制增殖作用(P<0.05),呈剂量依赖性;且同浓度m TORC1抑制剂与顺铂联合使用时抑制细胞增殖作用显著增加(P<0.05)。KRAS突变型肺癌细胞给予顺铂刺激时,P-4EBP及P-S6K水平显著提高(P<0.05),m TORC1被显著激活,这一升高可被m TORC1抑制剂降低(P<0.05)。结论:KRAS突变型肺癌患者对化疗药物敏感性的产生可能与m TORC1的激活有关,m TORC1抑制剂可以通过抑制m TORC1的激活增强KRAS突变型肺癌患者对化疗药物敏感性;且顺铂与m TORC1抑制剂联合使用具有更好的抑制KRAS突变型肺癌细胞增殖的作用。

关键词： Kirsten大鼠肉瘤病毒基因同源物突变型肺癌哺乳动物雷帕霉素靶蛋白1 化疗药物耐药

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