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哺乳动物双杂交技术验证HBV表面抗原大蛋白与人胰腺CDK5RAP3蛋白间的相互作用

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新疆医科大学学报 2010年第2期33卷 113-115页

作者：巩雪俐张丽张建龙张锦前新疆医科大学基础医学院病理生理学教研室新疆乌鲁木齐830011 新疆医科大学基础医学院组织胚胎学教研室新疆乌鲁木齐830011 北京地坛医院传染病研究所北京100015

目的验证HBV表面抗原大蛋白(LHBs)与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内是否存在相互作用关系,为进一步研究HBV影响糖、脂代谢机制奠定研究基础。方法构建真核表达质粒pACT-CDK5RAP3,哺乳动物双杂交技术验证LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白之间的相... 详细信息

目的验证HBV表面抗原大蛋白(LHBs)与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内是否存在相互作用关系,为进一步研究HBV影响糖、脂代谢机制奠定研究基础。方法构建真核表达质粒pACT-CDK5RAP3,哺乳动物双杂交技术验证LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白之间的相互作用。结果实验组和各阴性对照组差别均有统计学意义(P<0.05)。结论LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内存在相互作用关系,且单独转染后没有自身激活作用。

关键词： HBV表面抗原大蛋白胰腺癌细胞哺乳动物双杂交

哺乳动物双杂交技术验证HBV表面抗原大蛋白与胰腺弹性蛋白酶2A的相互作用

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国际病毒学杂志 2013年第2期20卷 63-66页

作者：刘文祥张楠汪涛侯鹏中国人民解放军总医院第一附属医院消化科北京100048 青海省青藏兵站部机关门诊部

目的验证乙型肝炎病毒（hepatitisBvires，HBV）表面抗原大蛋白（hepatitisBvireslargesurfaceprotein，LHBs）与人胰腺弹性蛋白酶2A（elastase2A）蛋白在细胞内是否存在明确的相互作用关系。方法构建真核表达质粒pACT—Elastase2A，设... 详细信息

目的验证乙型肝炎病毒（hepatitisBvires，HBV）表面抗原大蛋白（hepatitisBvireslargesurfaceprotein，LHBs）与人胰腺弹性蛋白酶2A（elastase2A）蛋白在细胞内是否存在明确的相互作用关系。方法构建真核表达质粒pACT—Elastase2A，设立阳性对照组、实验组、阴性对照组和空细胞组，用哺乳动物双杂交技术验证LHBs与人胰腺Elastase2A蛋白之间的相互作用。结果实验组与3个阴性对照组之间，均数都存在统计学差异（其P值分别为0．031、0．006和0．007）。结论哺乳动物双杂交技术证实了从慨与人胰腺Elastase2A蛋白在Capan2细胞内存在相互作用关系。

关键词：乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白人胰腺弹性蛋白酶2A 哺乳动物双杂交

基于哺乳动物双杂交技术靶向HIV-1gp41的新抗HIV进入抑制剂药物高通量筛选模型的建立

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基于哺乳动物双杂交技术靶向HIV-1gp41的新抗HIV进入抑制剂药物高...

基于哺乳动物双杂交技术靶向HIV-1 gp41的新抗HIV进入抑制剂药物高通量筛选模型的建立

2009年中国药学大会暨第九届中国药师周

作者：小溪刘晨郑智慧路新华张华贺建功河北师范大学生命科学学院华北制药集团新药研发中心天然药物室

gp41是HIV-1表面的包膜糖蛋白(Env)成分,介导了病毒膜和宿主细胞膜间的融合,在HIV-1的侵染过程中起关键作用。gp41中的N末端重复序列(NHR)和C末端重复序列(CHR)通过相互作用形成关键的核心三聚体发夹状结构,从而介导HIV膜和宿主细胞膜... 详细信息

gp41是HIV-1表面的包膜糖蛋白(Env)成分,介导了病毒膜和宿主细胞膜间的融合,在HIV-1的侵染过程中起关键作用。gp41中的N末端重复序列(NHR)和C末端重复序列(CHR)通过相互作用形成关键的核心三聚体发夹状结构,从而介导HIV膜和宿主细胞膜的融合过程。抑制gp41中的NHR和CHR的核心三聚体形成已经成为抗HIV药物的新靶点。本研究利用哺乳动物双杂交技术检测蛋白之间相互作用的原理,建立新的靶向HIV-1gp41抗HIV药物高通量筛选模型。将PCR扩增的gp41NHR和CHR基因片段分别连接至哺乳动物双杂交的pACT和pBIND载体上构建表达载体pACT-NHR和pBIND-CHR,用脂质体与已经构建好的报告质粒pGl3-GAL4进行共转染动物细胞。通过检测荧光素酶基因的表达水平定量评价化合物对NHR和CHR的相互作用的拮抗活性。经过多种条件的优化,使得筛选模型的信号本底比达10,Z’因子大于0.5。阳性对照化合物XTT在本模型中可以浓度依赖地降低荧光素酶的表达,其IC50为13.54μg/mL(20.1μM),证明该模型具有很好的灵敏度和稳定性,可以用于大量药物筛选。本研究建立的全新靶向gp41的抗HIV小分子药物筛选模型,为发现和研究新一代的抗HIV药物研究打下坚实的基础。

关键词： gp41 NHR CHR 哺乳动物双杂交高通量筛选

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基于哺乳动物双杂交技术靶向HIV-1 gp41的新抗HIV进入抑制剂药物...

HCBP1的细胞定位及与HCV核心蛋白在体内的相互作用

2010年中国药学大会暨第十届中国药师周

作者：水小溪刘晨郑智慧路新华张华贺建功河北师范大学生命科学学院华北制药集团新药研发中心天然药物室

gp41是HIV-1表面的包膜糖蛋白（Env）成分,介导了病毒膜和宿主细胞膜间的融合,在HIV-1的侵染过程中起关键作用。gp41中的N末端重复序列（NHR）和C末端重复序列（CHR）通过相互作用形成关键的核心三聚体发夹状结构,从而介导HIV膜和宿主... 详细信息

gp41是HIV-1表面的包膜糖蛋白（Env）成分,介导了病毒膜和宿主细胞膜间的融合,在HIV-1的侵染过程中起关键作用。gp41中的N末端重复序列（NHR）和C末端重复序列（CHR）通过相互作用形成关键的核心三聚体发夹状结构,从而介导HIV膜和宿主细胞膜的融合过程。抑制gp41中的NHR和CHR的核心三聚体形成已经成为抗HIV药物的新靶点。本研究利用哺乳动物双杂交技术检测蛋白之间相互作用的原理,建立新的靶向HIV-1gp41抗HIV药物高通量筛选模型。将PCR扩增的gp41NHR和CHR基因片段分别连接至哺乳动物双杂交的pACT和pBIND载体上构建表达载体pACT-NHR和pBIND-CHR,用脂质体与已经构建好的报告质粒pGl3-GAL4进行共转染动物细胞。通过检测荧光素酶基因的表达水平定量评价化合物对NHR和CHR的相互作用的拮抗活性。经过多种条件的优化,使得筛选模型的信号本底比达10,Z’因子大于0.5。阳性对照化合物XTT在本模型中可以浓度依赖地降低荧光素酶的表达,其IC50为13.54μg/mL（20.1μM）,证明该模型具有很好的灵敏度和稳定性,可以用于大量药物筛选。本研究建立的全新靶向gp41的抗HIV小分子药物筛选模型,为发现和研究新一代的抗HIV药物研究打下坚实的基础。

关键词： gp41 NHR CHR 哺乳动物双杂交高通量筛选

来源： cnki会议评论

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南方医科大学学报 2007年第12期27卷 1809-1812页

作者：陈天艳刘敏陈云茹蔺淑梅叶峰张曦刘锦锋赵英仁张树林西安交通大学医学院第一附属医院传染科陕西西安710061

目的探讨HCV核心蛋白与(HCBP1)HCV核心蛋白的相互作用蛋白在真核细胞内的相互作用。构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与HCBP1融合蛋白真核表达载体,分析其在COS-7细胞中的表达和亚细胞定位。方法PCR分别扩增含HCV核心及HCBP1的cDNA片段,克... 详细信息

目的探讨HCV核心蛋白与(HCBP1)HCV核心蛋白的相互作用蛋白在真核细胞内的相互作用。构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与HCBP1融合蛋白真核表达载体,分析其在COS-7细胞中的表达和亚细胞定位。方法PCR分别扩增含HCV核心及HCBP1的cDNA片段,克隆入pGEMT载体,经测序正确后,分别克隆入哺乳双杂交的表达质粒pM和pVP16中,并转染入COS-7细胞,48h后检测细胞中报告基因CAT的表达水平。将HCBP1的cDNA片段克隆入绿色荧光表达载体pEGFP-C1中,构建HCBP1-EGFP融合蛋白的表达载体,转染COS-7细胞,以Western blot和荧光显微镜分析融合蛋白的表达及其细胞定位。结果CAT-ELISA检测显示pM-核心蛋白与pVP16-HCBP1实验孔吸光度值高于其他阴性对照,但低于阳性对照组。成功构建HCBP1-EGFP融合蛋白的表达载体,Western blot证实融合蛋白在转染细胞中的表达,荧光显微镜示HCBP1-EGFP融合蛋白分布于细胞浆,而转染空载体的细胞内EGFP的分布无明显改变。结论成功构建HCBP1-EGFP融合蛋白表达载体,并在COS-7细胞中得到表达。哺乳双杂交系统证实HCV核心蛋白与新基因HCBP1确有一定的相互作用。

关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白哺乳动物双杂交绿色荧光蛋白融合蛋白

以HIF-1α和P300相互作用为靶点的抑制剂筛选模型的建立

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药学学报 2014年第6期49卷 849-853页

作者：来芳芳牛非杨瀚泽周琬琪陈晓光中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所、天然药物活性物质与功能国家重点实验室北京100050

本研究以HIF-1α和P300的相互作用为靶点,设计并构建了基于哺乳动物双杂交体系的HIF-1特异性抑制剂筛选方法。通过克隆HIF-1α和P300相互作用的基因序列,成功构建重组质粒pBIND-HIF1α和pACT-P300,进而在HEK293细胞中验证了HIF-1α和P30... 详细信息

本研究以HIF-1α和P300的相互作用为靶点,设计并构建了基于哺乳动物双杂交体系的HIF-1特异性抑制剂筛选方法。通过克隆HIF-1α和P300相互作用的基因序列,成功构建重组质粒pBIND-HIF1α和pACT-P300,进而在HEK293细胞中验证了HIF-1α和P300蛋白在哺乳动物双杂交体系中确实存在直接的相互作用,并进一步优化了模型构建条件。化合物黑毛霉素(chetomin)、甲萘醌(menadione)在此筛选模型上能抑制其相互作用。在此基础上,联合U251-HRE的HIF-1转录活性抑制剂筛选方法,充分肯定了黑毛霉素能有效抑制HIF-1活性。因此,联合哺乳动物双杂交和U251-HRE这两个细胞模型,成功建立了以HIF-1α和P300相互作用为靶点的筛选模型,为特异性小分子肿瘤靶向药物的开发奠定了基础。

关键词：缺氧诱导因子1-α P300 相互作用哺乳动物双杂交筛选

ASGPR与HBV preS1蛋白之间相互作用的验证

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西安交通大学学报（医学版） 2016年第2期37卷 292-297页

作者：张曦刘小静陈云茹孔颖杨雪亮叶峰蔺淑梅西安交通大学第一附属医院感染科陕西西安710061

目的验证去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)与乙肝病毒前S1蛋白(HBV preS1蛋白)之间的相互作用,确认ASGPR作为乙肝病毒肝细胞膜受体在介导乙肝病毒感染的分子机制中的作用。方法分别用哺乳动物双杂交及体外免疫共... 详细信息

目的验证去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)与乙肝病毒前S1蛋白(HBV preS1蛋白)之间的相互作用,确认ASGPR作为乙肝病毒肝细胞膜受体在介导乙肝病毒感染的分子机制中的作用。方法分别用哺乳动物双杂交及体外免疫共沉淀技术验证ASGPR与HBV preS1蛋白之间的相互作用,操作方法参照试剂盒说明书进行。结果哺乳动物双杂交实验结果提示,ASGPR与HBV preS1蛋白在细胞环境中具有相互作用;免疫共沉淀实验结果提示,ASGPR与HBV preS1蛋白在非细胞环境中具有相互作用。结论 ASGPR可能是介导HBV入侵的肝细胞膜受体之一。

关键词：乙型肝炎病毒 preS1蛋白 ASGPR 蛋白质-蛋白质相互作用哺乳动物双杂交免疫共沉淀

HCV NS5A结合蛋白顺乌头酸酶1的验证研究

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山东医药 2011年第32期51卷 36-38页

作者：王晓杰相久全韩乐强张锦前成军首都医科大学附属北京地坛医院北京100015 密云县第二医院大连市第六人民医院

目的筛选人肝脏cDNA文库中与HCV NS5A的结合蛋白基因,验证其中顺乌头酸酶1与HCV NS5A的相互作用。方法应用酵母双杂交系统3筛选人肝脏cDNA文库中的HCV NS5A结合蛋白基因,应用哺乳动物双杂交及免疫共沉淀技术验证其中顺乌头酸酶1蛋白与HC... 详细信息

目的筛选人肝脏cDNA文库中与HCV NS5A的结合蛋白基因,验证其中顺乌头酸酶1与HCV NS5A的相互作用。方法应用酵母双杂交系统3筛选人肝脏cDNA文库中的HCV NS5A结合蛋白基因,应用哺乳动物双杂交及免疫共沉淀技术验证其中顺乌头酸酶1蛋白与HCV NS5A之间的相互作用。结果成功筛选出人肝脏cD-NA文库中与HCV NS5A存在相互作用的蛋白基因,哺乳动物双杂交及免疫共沉淀实验结果证实HCV NS5A与顺乌头酸酶1蛋白在HepG2细胞内存在相互作用。结论本实验成功筛选人肝脏cDNA文库中的HCV NS5A结合蛋白基因,并且在体外水平即细胞内证实HCV NS5A与其中的顺乌头酸酶1蛋白之间的相互作用,为进一步细胞内及体内的糖、脂类代谢等功能研究奠定基础。

关键词： HCV NS5A 顺乌头酸酶1 酵母双杂交哺乳动物双杂交免疫共沉淀

绵羊精子特异性蛋白TSSK6与IZUMO1相互作用的研究

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绵羊精子特异性蛋白TSSK6与IZUMO1相互作用的研究

作者：李志朋内蒙古大学

学位级别：硕士

哺乳动物的受精作用是一个精密且复杂的生理过程,主要包括精子获能、精子与卵子透明带结合引发顶体反应、精子和卵子膜融合三个主要过程。精子膜上的蛋白质之间的相互作用为之后的精卵融合创造了结构基础,近来研究表明,鼠精子特异性蛋... 详细信息

哺乳动物的受精作用是一个精密且复杂的生理过程,主要包括精子获能、精子与卵子透明带结合引发顶体反应、精子和卵子膜融合三个主要过程。精子膜上的蛋白质之间的相互作用为之后的精卵融合创造了结构基础,近来研究表明,鼠精子特异性蛋白精卵融合蛋白IZUMO1在精子膜上的运动跟另一个精子特异性蛋白激酶TSSK6有关,但是两者之间是否有直接的相互作用还没有被证明。本文用酵母双杂交、免疫共沉淀和哺乳动物双杂交技术鉴定了 IZUMO1与TSSK6之间的相互作用。本实验选取绵羊的睾丸组织,克隆出长度为985 bp的Tssk6的cDNA全长,并上传至NCBI,登录号为KY914489。其中CDS区中的第144位和672位碱基与GenBank预测的序列存在差异,但没有发生氨基酸改变。将Tssk6和本实验室已有的绵羊Izumo1 cDNA分别插入pGEX-4T1构建pGEX-Tssk6和pGEX-Izumo1原核表达载体,在大肠杆菌中表达重组蛋白TSSK6-GST和IZUMO1-GST,提取纯化后分别免疫小鼠和家兔,得到兔抗的IZUMO1血清抗体和鼠抗的TSSK6血清抗体。酵母双杂交实验中,我们把转化了pGAD-Tssk6的Y2H酵母菌和转化了Pgbk-Izumo1的Y187酵母菌进行杂交,杂交后代可以在SD/-Trp-Leu二缺培养基和SD/-Ade-His-Trp-Leu培养基上分别长出蓝色菌落,实验结果说明TSSK6和IZUMO1在酵母细胞中发生了相互作用。在哺乳动物双杂交实验中,把pFN-10A-Izumo1/pFN-11A-Tssk6和报告基因载体PGL4.31共转染人293T细胞,然后进行双荧光素酶报告基因检测,并对结果进行差异显著性分析。其中阳性对照组p<0.05,实验组p<0.01,实验结果说明IZUMO1和TSSK6在人293T细胞中发生了较强的相互作用。在免疫共沉淀实验中,我们将pCMV-Flag-Tssk6和pCMV-HA-Izumo1载体共转染293T细胞,·然后使用抗HA标签的磁珠抗体对IZUMO1-HA进行沉淀,用抗Flag标签的抗体进行Western-blot检测,蛋白印迹结果显示IZUMO1-HA蛋白与TSSK6-Flag蛋白一起被沉淀下来,这说明TSSK6和IZUMO1在293T细胞中是结合在一起的。综合以上实验结果,我们可以确定IZUMO1和TSSK6之间发生了直接的相互作用。

关键词： Tssk6 Izumo1 酵母双杂交哺乳动物双杂交免疫共沉淀