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作者：陈钰臻上海海洋大学

学位级别：硕士

许氏平鲉(Sebastes schlegelii)是我国北方沿海地区网箱养殖、资源增殖和休闲垂钓的理想鱼种。近年来,随着许氏平鲉养殖规模的扩大以及受病害防控技术的限制,养殖病害时有发生,病害种类越来越多,其中以细菌性疾病最为常见。弧菌是一种... 详细信息

许氏平鲉(Sebastes schlegelii)是我国北方沿海地区网箱养殖、资源增殖和休闲垂钓的理想鱼种。近年来,随着许氏平鲉养殖规模的扩大以及受病害防控技术的限制,养殖病害时有发生,病害种类越来越多,其中以细菌性疾病最为常见。弧菌是一种广泛分布于海洋中的细菌,由哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)引起的弧菌病已被认为是水产养殖过程中的主要疾病之一,严重制约了养殖产业的健康持续发展。本研究从患病许氏平鲉病灶处分离纯化出一株特征明显的优势菌p5w,采用16S r DNA基因序列分析法将其鉴定为哈维氏弧菌,并对其理化特征、胞外产物活性、组织病理及药敏反应等进行了研究,分析了p5w的致病力,探讨了p5w的致病机理,明确了p5w的药物敏感性;基于RNA-seq测序技术,进一步分析了p5w感染后许氏平鲉的转录组差异,明确了许氏平鲉应答哈维氏弧菌感染的主要信号通路和免疫基因,研究结果为哈维氏弧菌疾病的防控提供了数据参考。1.许氏平鲉致病菌哈维氏弧菌p5w的分离鉴定本研究从患病许氏平鲉病灶处分离纯化出一株特征明显的优势菌p5w,其菌落在2216E培养基上呈灰白色、表面光滑湿润,在TCBS培养基上呈黄色、边缘规则光滑,革兰氏染色呈阴性,吲哚反应和氧化酶试验均呈阳性,可水解七叶灵和明胶、酸化葡萄糖、同化苹果酸,基于形态学观察、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析将其鉴定为哈维氏弧菌。人工感染实验确定了p5w对许氏平鲉的致病性,LD为5.7×10 CFU/mL。2.哈维氏弧菌p5w的生长特性分析、组织病理学观察、胞外产物活性分析及药物敏感性检测本研究分析了不同温度、pH、盐度等理化因子对p5w生长的影响,结果表明p5w适宜生长的条件为温度15～35℃,pH5～10,NaCl含量(w/v%)1～8;分别取健康和患病的许氏平鲉肝、脾等组织进行组织病理学观察,结果显示患病鱼肝细胞呈明显空泡化,肝细胞萎缩且胞内物质颜色加深,脾脏组织细胞离散,含铁血黄素沉积,肾小管部分上皮细胞坏死,肾小球萎缩,肌纤维结构出现断裂、坏死现象;通过分析p5w的胞外产物活性及溶血性,结果显示p5w的胞外产物具有蛋白酶、脂肪酶、卵磷脂酶、淀粉酶、尿素酶及明胶酶活性,对绵羊血有溶血性;检测了p5w对不同抗菌药物的敏感性,结果显示p5w对头孢曲松及四环素等药物尤为敏感,对红霉素、头孢哌酮以及庆大霉素等药物中度敏感或不敏感。3.许氏平鲉血液在哈维氏弧菌p5w感染前后的转录组分析选取空白对照组(B-0h)、感染后12 h实验组(B-12h-E)和对照组(B-12h-C)、感染后48 h实验组(B-48h-E)和对照组(B-48h-C)为实验时间节点,对许氏平鲉血液的15个样本进行高通量测序。共获得1,019,795,876个raw reads,质控后得到889,746,122个clean reads,拼接获得104,976个unigene序列,平均长度为1,080.28,N50为1,478;通过NR,GO,COG,KEGG和Swiss-prot数据库对拼接基因进行功能注释,成功注释36,822个基因。差异基因表达分析中,12 h对照组和12 h实验组血液样品间筛选出8,391个差异表达基因,48 h实验组和48 h对照组血液样品间筛选出2,805个差异表达基因。通过GO富集和KEGG富集对筛选的差异基因进行分析,获得了细菌防御、免疫激活、免疫调节等大量与免疫有关的terms以及NOD-like信号通路、坏死性凋亡、T细胞受体信号通路等pathways,进一步对富集到上述通路中的免疫基因进行分析,筛选出CCL4、CCNB1、FADD等与免疫有关的差异表达基因。4.许氏平鲉脾脏在哈维氏弧菌p5w刺激前后的转录组分析选取空白对照组(S-0h)、感染后12 h实验组(S-12h-E)和对照组(S-12h-C)、感染后48 h实验组(S-48h-E)和对照组(S-48h-C)为实验时间节点,对许氏平鲉脾脏的15个样本进行高通量测序。共获得992,503,854个raw reads,质控后得到872,919,720个clean reads,占raw reads的87.95%。差异基因表达分析中,12 h对照组和12 h实验组脾脏样品间筛选出4,571个差异表达基因,48 h实验组和48 h对照组血液样品间筛选出5,378个差异表达基因。通过GO富集和KEGG富集对筛选的差异基因进行分析,获得了免疫细胞凋亡调控、免疫球蛋白、免疫细胞活性调节等大量与免疫有关的terms以及坏死性凋亡、抗原处理和递呈等pathways,进一步对富集到上述通路中的免疫基因进行分析,筛选出MHC1、CD22、IL4I1等与免疫有关的差异表达基因。

关键词：许氏平鲉哈维氏弧菌p5w 病原病理 RNA-seq 转录组免疫相关基因

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许氏平鲉致病菌p5w的分离鉴定及致病力分析

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海洋湖沼通报 2023年第5期45卷 44-52页

作者：陈钰臻王腾腾韩慧宗崔广鑫王斐张明亮姜海滨上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心上海201306 山东省海洋资源与环境研究院山东省海洋生态修复重点实验室山东烟台264006 上海海洋大学水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心上海201306

为明确养殖过程中许氏平鲉(Sebastes schlegelii)病害爆发的原因,本研究从烟台养殖区自然发病的许氏平鲉病灶处分离获得1株优势菌株p5w,综合采用形态特征观察、结合线粒体16S rDNA序列比对与系统发育进化鉴定分析,明确菌株p5w为哈维氏弧... 详细信息

为明确养殖过程中许氏平鲉(Sebastes schlegelii)病害爆发的原因,本研究从烟台养殖区自然发病的许氏平鲉病灶处分离获得1株优势菌株p5w,综合采用形态特征观察、结合线粒体16S rDNA序列比对与系统发育进化鉴定分析,明确菌株p5w为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。进一步开展了人工感染实验、组织病理学观察、胞外产物酶活性及溶血性分析、理化特性及药敏实验等研究,结果显示:人工感染证实菌株p5w为导致此次许氏平鲉患病的病原菌,且半数致死量LD50为5.7×10^(6)CFU/mL;患病许氏平鲉肝、脾、肾和肌肉等组织器官出现了不同程度的病变,主要表现在肝细胞出现明显空泡化,脾脏组织细胞发生离散,肾小管上皮细胞脱落坏死,肌纤维断裂;p5w胞外产物具有蛋白酶、脂肪酶、卵磷脂酶、淀粉酶、尿素酶及明胶酶活性,对绵羊红细胞有溶血活性;p5w的适宜生长条件为15~35℃, pH值5~10, NaCl含量(w/v%)1~8,最适生长条件为温度25℃, pH值7, NaCl含量2~4;p5w对头孢噻肟、头孢曲松、左氟沙星、四环素、复方新诺明等13种药物尤为敏感。研究结果为许氏平鲉养殖过程中弧菌类疾病的防治提供了理论和实践指导。

关键词：许氏平鲉哈维氏弧菌p5w 鉴定组织病理学胞外产物致病力

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