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呼肠孤病毒与SARS相关的形态学依据

中国病毒学 2005年第2期20卷 105-107页

作者：杨怡陈德蕙端青朱虹郎振为孟忻张德添张飒国家生物医学分析中心北京100850 军事医学科学院微生物流行病研究所北京100710 北京佑安医院病理科北京100054

SARS患者病理尸检肺组织样品分离病毒出现细胞病变的Hep2培养细胞,按常规制作超薄切片,透射电镜下观察.电镜下,检出在感染细胞内复制、组装的呼肠孤病毒及其包涵体.病毒粒子衣壳立体对称、无包膜、直径在60～80nm.成熟病毒粒子核心致密... 详细信息

SARS患者病理尸检肺组织样品分离病毒出现细胞病变的Hep2培养细胞,按常规制作超薄切片,透射电镜下观察.电镜下,检出在感染细胞内复制、组装的呼肠孤病毒及其包涵体.病毒粒子衣壳立体对称、无包膜、直径在60～80nm.成熟病毒粒子核心致密常排列呈晶格状,不成熟病毒粒子核心空亮.数目不等的上述两种病毒粒子、长短不等的微管样结构和病毒浆常在核旁胞质内组成大小不等、无定形的病毒包涵体.此发现进一步提供了呼肠孤病毒感染有可能与SARS相关的形态学依据.

关键词：呼肠孤病毒 SARS 电子显微术

呼肠孤病毒番鸭不同分离株部分基因重组子代病毒与致病性的研究

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呼肠孤病毒番鸭不同分离株部分基因重组子代病毒与致病性的研究

作者：孙雅萍福建农林大学

学位级别：硕士

禽呼肠孤病毒(ARV)是番鸭“肝白点病或花肝病”的病原,病毒基因组含有10个双股RNA片段,分为L、M和S三组,其中S组4个小基因节段是研究ARV遗传演化的关键,已发现ARV分离株S组基因具有两种基因型:一种基因型的代表株为DRV-89026和DRV-89330... 详细信息

禽呼肠孤病毒(ARV)是番鸭“肝白点病或花肝病”的病原,病毒基因组含有10个双股RNA片段,分为L、M和S三组,其中S组4个小基因节段是研究ARV遗传演化的关键,已发现ARV分离株S组基因具有两种基因型:一种基因型的代表株为DRV-89026和DRV-89330(禽(番鸭)呼肠孤病毒YB株为此基因型),另一种基因型的代表株为ARV-S1133(禽(番鸭)呼肠孤病毒YJL株为此基因型)。在禽呼肠孤病毒中存在基因重组(配)的现象,即当两个有亲缘关系但生物学性状不同的毒株同时感染细胞时,可产生发生基因片段交换的子代病毒。与亲本毒株相比,产生的子代重组(配)毒株的生物学性状可能发生改变,或子代病毒对其宿主的致病力与亲本病毒存在差异,甚至由于基因重组(配)可能产生新的血清型。本试验通过模拟自然感染情况下,利用本实验室保存的两株禽(番鸭)呼肠孤病毒(YB和YJL)同时感染细胞,获得发生基因片段重组的子代病毒后,研究其生物学性状的改变以及在致病性上与亲本株病毒的差异。首先,蚀斑法纯化亲本毒株。其次,从Genebank上读取法国分离株DRV-89026和DRV-89330,美国分离株ARV-S1133和176,以及我国分离株S14的S组基因节段编码的σC,σNS,σB,σA四个蛋白的核苷酸序列设计8对引物,分别建立含有两亲本株S组四条基因片段的多重RT-PCR检测方法。再次,两亲本毒株共同感染禽胚成纤维细胞后,根据蚀斑形状、大小等培养性状的不同,挑取可能为重组子代的病毒蚀斑,分别用两亲本毒株的多重RT-PCR方法检测,获得发生基因片段重组的子代病毒。最后,将亲本毒株与重组(配)子代病毒分别接种禽胚成纤维细胞、禽胚卵黄囊、一日龄雏鸡和雏番鸭爪垫,研究重组(配)子代病毒生物学性状的改变以及其对宿主在致病性方面与亲本毒株的差异。通过本实验得出的结果有:⑴禽(番鸭)呼肠孤病毒在禽胚成纤维细胞上形成圆形,边缘较整齐的蚀斑,经中性红染色可见白色空斑。⑵禽胚死亡时间的差异:鸡胚死亡时间:YB,9d-14d;YJL,65-71h;重组(配)子代Ⅰ,56-61h;重组(配)子代Ⅱ,7d-10d。番鸭胚死亡时间:YB,134-229h;YJL,90-95h;重组(配)子代Ⅰ,66-76h;重组(配)子代Ⅱ,93-117h。⑶死亡胚体出血情况的差异:重组(配)子代Ⅰ>YJL>重组(配)子代Ⅱ>YB。⑷一日龄雏鸡和雏番鸭爪垫接种病毒死亡剖检后,病变组织的差异:重组(配)子代与亲本毒株相比较,病变部位较多,相同组织发生病变情况较严重。亲本毒株接种雏鸡和雏番鸭后,主要病变集中于肝脏和脾脏;而重组子代病毒接种雏鸡和雏番鸭后,病变除肝脏和脾脏外,还可见胰腺有出血点,胸腺出血,卵黄吸收不良等。⑸重组子代毒株与亲本株TCID50的测定结果:YB,10-6.5;YJL,10-7.24;重配子代Ⅰ,10-7.77;重配子代Ⅱ,10-7.53。⑹病理切片结果显示:重组子代毒株较亲本毒株而言,各组织内出现较多坏死灶,细胞严重变性坏死,淋巴组织内淋巴细胞减少,对各组织及细胞造成更为严重的破坏。⑺经软件分析后可知,禽呼肠孤病毒两亲本株YB与YJLσA蛋白的氨基酸序列同源性为88%;σB蛋白的氨基酸序列同源性为61%。⑻禽(番鸭)呼肠孤病毒两亲本株YB和YJLσA蛋白的二级结构以及亲水性和疏水性差异较小;σB蛋白的二级结构差异较大,尤其是在氨基酸的第90-200位之间。由结果可知:⑴经本实验证明,当两种禽(番鸭)呼肠孤病毒(YB和YJL)同时感染禽胚成纤维细胞时,会出现基因重组(基因重配)的现象。⑵由实验结果可得出,重组子代病毒的生物学特性有所改变,包括其在禽胚成纤维细胞上形成蚀斑的能力、对禽胚的致病力(禽胚死亡时间、死亡胚体出血情况)以及爪垫接种感染一日龄雏鸡和雏番鸭后发生病变的器官和组织等。并且重组子代病毒较亲本病毒而言,宿主对其易感性更高。⑶经本实验证明,对于同一种细胞(禽胚成纤维细胞),禽(番鸭)呼肠孤病毒形成蚀斑的能力与病毒的感染力有关。⑷结合σA和σB蛋白二级结构分析与重组子代与亲代之间对宿主致病性的差异可见,病毒蛋白的空间结构对病毒毒力的发挥有重要作用。当发生基因重组后,子代病毒蛋白空间结构差异越大,对其毒力或致病性影响越大。

关键词：呼肠孤病毒番鸭基因重组基因重配蚀斑多重RT-PCR 致病性

草鱼呼肠孤病毒HZ08株VP4蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

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中国生物制品学杂志 2011年第12期24卷 1482-1485页

作者：曾伟伟王庆张乐生刘宝芹刘永奎石存斌曾令兵吴淑勤农业部淡水生物多样性保护与利用重点开放实验室中国水产科学研究院长江水产研究所武汉430223 中国水产科学研究院珠江水产研究所广州510380

目的原核表达、纯化草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)HZ08株VP4蛋白,并制备其多克隆抗体。方法采用PCR法扩增GCRV HZ08株S6基因部分节段,插入原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-32a-S6,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPT... 详细信息

目的原核表达、纯化草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)HZ08株VP4蛋白,并制备其多克隆抗体。方法采用PCR法扩增GCRV HZ08株S6基因部分节段,插入原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-32a-S6,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测定其效价,Western blot鉴定其特异性。结果重组表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;表达的目的蛋白相对分子质量约为51 000,表达量占菌体总蛋白的73%,主要以包涵体形式表达,反应原性良好;制备的多克隆抗体效价约为1∶8 000,且具有较高的特异性。结论成功制备了GCRV HZ08株VP4蛋白高效价多克隆抗体,为VP4蛋白功能的深入研究、抗原表位分析、草鱼出血病诊断方法的建立及相关基因工程疫苗的研发奠定了基础。

关键词：呼肠孤病毒草鱼 VP4蛋白多克隆抗体

一例番鸭呼肠孤病毒与鸭疫里默氏菌共感染的实验室诊断

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福建畜牧兽医 2022年第6期44卷 18-20页

作者：谢碧林林志敏林彬彬翁汉东莆田市农业科学研究所福建莆田351100

为确定某22日龄雏番鸭死亡原因,无菌采集病死番鸭的脑组织分离细菌,PCR鉴定;采集病变脏器研磨后检测雏番鸭常见病原。结果分离到1株鸭疫里默氏菌,敏感药物有氨苄西林、阿莫西林、头孢唑林、头孢曲松、头孢西丁、头孢他啶、头孢吡肟、四... 详细信息

为确定某22日龄雏番鸭死亡原因,无菌采集病死番鸭的脑组织分离细菌,PCR鉴定;采集病变脏器研磨后检测雏番鸭常见病原。结果分离到1株鸭疫里默氏菌,敏感药物有氨苄西林、阿莫西林、头孢唑林、头孢曲松、头孢西丁、头孢他啶、头孢吡肟、四环素、强力霉素、环丙沙星、氟苯尼考。常见病毒检测,仅番鸭呼肠孤病毒检测为阳性。综合临床症状、剖检病变及实验室检测结果,诊断为番鸭呼肠孤病毒与鸭疫里默氏菌共感染病例。

关键词：雏番鸭呼肠孤病毒鸭疫里默氏菌共感染

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呼肠孤病毒内源性转录的结构基础

中国病毒学 2004年第5期19卷 535-539页

作者：方勤丁清泉中国科学院武汉病毒研究所中国科学院分子病毒重点实验室湖北武汉430071

呼肠孤病毒为自然界特有的分段dsRNA基因组,其宿主范围十分广泛,包括哺乳动物、无脊椎动物、植物、真菌与细菌.随着结构生物学与信息处理等新技术的运用与发展,近年来,在呼肠孤病毒结构研究方面已取得突破性成果.特别是运用X射线晶体衍... 详细信息

呼肠孤病毒为自然界特有的分段dsRNA基因组,其宿主范围十分广泛,包括哺乳动物、无脊椎动物、植物、真菌与细菌.随着结构生物学与信息处理等新技术的运用与发展,近年来,在呼肠孤病毒结构研究方面已取得突破性成果.特别是运用X射线晶体衍射及低温电镜与三维重构术对呼肠孤病毒核心蛋白与完整颗粒结构高分辨率的解析,不仅揭示了呼肠孤病毒核衣壳蛋白所具有的转录酶活性,同时阐明了内源性RNA转录与调节的结构基础.……

关键词：呼肠孤病毒内源性转录结构基础

呼肠孤病毒感染体外扩增的CIK及NK细胞后联合西妥昔单抗的抗结直肠癌效应的初步研究

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呼肠孤病毒感染体外扩增的CIK及NK细胞后联合西妥昔单抗的抗结直...

作者：孔娟贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:研究体外扩增的自然杀伤细胞(NK)及CIK细胞(CIK)在联合西妥昔单抗(cetuximab)后对人EGFR阳性的结直肠癌细胞株DLD-1及Caco-2的杀伤效应,以及呼肠孤病毒(reovirus)能否进一步增强CIK及NK细胞与cetuximab的联合抗肿瘤效应,为临床结... 详细信息

目的:研究体外扩增的自然杀伤细胞(NK)及CIK细胞(CIK)在联合西妥昔单抗(cetuximab)后对人EGFR阳性的结直肠癌细胞株DLD-1及Caco-2的杀伤效应,以及呼肠孤病毒(reovirus)能否进一步增强CIK及NK细胞与cetuximab的联合抗肿瘤效应,为临床结直肠癌的治疗提供新的治疗策略。方法:从健康献血者的外周血分离出单个核细胞(PBMC),分别常规诱导出CIK细胞及NK细胞,收集培养第14天的CIK细胞及NK细胞,ELISA实验检测CIK细胞培养上清中IFN-γ及TGF-β的水平,通过流式细胞分析仪分析CIK细胞及NK表型及结直肠癌细胞DLD-1和Caco-2的EGFR受体的表达水平。分别采用RTCA(RTCA)及乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测NK细胞的细胞毒作用。利用TCID50法和甲基纤维素改良的噬斑实验测定reovirus病毒的滴度,使用不同滴度的reovirus病毒感染CIK细胞及NK细胞。采用实时无标记分析仪分别动态监测CIK及NK细胞在不同滴度reovirus感染后联合cetuximab对DLD-1及Caco-2细胞株的杀伤效应。结果:流式细胞仪检测CIK细胞亚群可见培养后CD8+T(67.5±16.5%)、CD3+CD56+NKT(20.1±13.7%)及CD16+CD56+NK细胞比例(7.0±6.6%)均较培养前CD8+T(26.7±9.5%)、CD3+CD56+NKT(3.1±1.8%)及CD16+CD56+NK(2.6±2.7%)显著增高;CIK细胞培养培养上清中细胞因子浓度IFN-γ水平由34.8±35.4 ng/L增高到2041.8±697.9ng/L(P病毒滴度分别为2.53×109pfu/L及1.36×109 pfu/L。RTCA检测发现NK细胞联合西妥昔单抗对结直肠癌细胞株杀伤作用明显高于单一的NK细胞组;CIK细胞对DLD-1及Caco-2细胞株的杀伤率分别为16.04±0.87%及27.67±3.10%,而当联合使用cetuximab后杀伤率分别增高到31.56±3.55%及35.96±1.73%,且用10pfu和100pfu滴度reovirus病毒感染CIK细胞及NK细胞后联合cetuximab对肿瘤细胞杀伤效应更明显。结论:CIK细胞及NK细胞联合cetuximab的杀伤效果明显增强,对KRAS野生型DLD-1细胞及KRAS突变型Caco-2细胞均有效,reovirus能进一步增强CIK细胞和NK细胞与cetuximab的联合抗肿瘤效应,为今后的临床研究奠定实验基础。

关键词： NK细胞 CIK细胞呼肠孤病毒西妥昔单抗结直肠癌

酵母双杂交筛选与呼肠孤病毒σ1、σ1S互作宿主蛋白

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中国兽医学报 2018年第10期38卷 1846-1851页

作者：杨丽娟张兰桥段怡芸戴益民赖芬菊江西农业大学生物科学与工程学院江西南昌330045 江西农业大学动物科学技术学院江西南昌330045

提取猪肠上皮细胞IPEC-1的总RNA,构建了IPEC-1的靶标cDNA文库。随机挑取文库克隆子进行PCR扩增,发现插入片段长度为200～1 500bp,文库的重组率为100%。以猪源呼肠孤病毒GD-1株S1基因节段为模板,通过PCR扩增,定向克隆构建诱饵载体pGBKT7... 详细信息

提取猪肠上皮细胞IPEC-1的总RNA,构建了IPEC-1的靶标cDNA文库。随机挑取文库克隆子进行PCR扩增,发现插入片段长度为200～1 500bp,文库的重组率为100%。以猪源呼肠孤病毒GD-1株S1基因节段为模板,通过PCR扩增,定向克隆构建诱饵载体pGBKT7-S1、pGBKT7-S1s。通过菌落PCR和测序验证的质粒被转化至酵母菌株Y2H Gold,诱饵载体pGBKT7-S1、pGBKT7-S1s均能在酵母细胞中正确表达出对应的σ1和σ1S蛋白,且无自激活活性,对酵母细胞无毒性,满足文库筛选实验的要求。将含有pGBKT7-S1、pGBKT7-S1s的酵母菌株Y2H Gold分别与靶标cDNA文库菌株Y187进行杂交,筛选、验证、测序后得到13个与σ1、6个与σ1S相互作用的宿主蛋白,其中的1个蛋白与σ1、σ1S同时存在相互作用。本试验成功构建了适用于研究肠道细菌、病毒作用机制的猪肠上皮细胞IPEC-1cDNA文库,筛选出18个与猪呼肠孤病毒σ1或σ1S的互作蛋白,为研究呼肠孤病毒与宿主相互作用,以及鉴定疾病控制的新靶标提供了线索。

关键词：呼肠孤病毒 IPHC-1 酵母双杂交互作蛋白筛选

反向遗传操作技术在呼肠孤病毒中的研究与应用

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病毒学报 2017年第6期33卷 950-958页

作者：汤亚方曾伟伟王庆王英英石存斌冯茹高辉王承宝西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 中国水产科学院珠江水产研究所农业部渔药创制重点实验室广东省水生动物免疫重点实验室广州510380

呼肠孤病毒科成员复杂,宿主范围广,对动物危害较大,使用经典遗传学方法解决呼肠孤病毒研究中出现的诸多科学问题受到限制,反向遗传学技术的发展和应用极大促进了呼肠孤病毒的基因组功能、蛋白质的作用、致病机制、新型疫苗开发等方面的... 详细信息

呼肠孤病毒科成员复杂,宿主范围广,对动物危害较大,使用经典遗传学方法解决呼肠孤病毒研究中出现的诸多科学问题受到限制,反向遗传学技术的发展和应用极大促进了呼肠孤病毒的基因组功能、蛋白质的作用、致病机制、新型疫苗开发等方面的研究。本文概述了呼肠孤病毒反向遗传操作技术的发展过程以及应用该技术取得的一些研究成果,并对该技术在呼肠孤病毒研究领域的推动作用进行了展望。

关键词：呼肠孤病毒反向遗传学病毒拯救应用进展

草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因功能区在原核细胞中的表达

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病毒学报 2002年第1期18卷 86-88页

作者：方勤朱作言淡水生态与生物技术国家重点实验室中国科学院水生生物研究所

An about 1.5kb functional domain sequence of GCRV-RdRp gene was obtained by using RT-PCR amplification.The amplified fragment was cloned into T7 promoted prokaryotic expression system pRSET-C vector and then was transformed into CaCl 2 treated TOP10F’and BL21(DE3)pLysS competent cells respectively.The recombinants were detected with restriction enzyme digestion and further confirmed the interest insert by sequencing pRSET-C/GCRV-RdRp plasmid,which was in frame with the N-terminal tag and in the proper orientation.SDS-PAGE revealed that the highly expressed fusion protein is produced by inducing with l nm IPTG,and its molecular weight is around 55kD,which is the right size corresponding to the predicted value.It indicated the fused protein was produced in the form of inclusion body with its yield remained steadly more than 60% of total bacterial protein. It also showed that the expressed protein was able to bind immunologically to rabbit anti-GCRV-VP2 serum.

关键词：草鱼呼肠孤病毒 RNA聚合酶基因表达原核细胞