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人真皮成纤维细胞中节律基因PER2与褪黑素受体1a抗衰老分子机制研究

人真皮成纤维细胞中节律基因PER2与褪黑素受体1a抗衰老分子机制研...

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作者：李妮虹昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]本课题通过探究人真皮成纤维细胞(Primary Dermal Fibroblast,Normal,Human,Adult,HDFa)中节律基因PER2、BMAL1、CRY1随时间周期性变化,并以PER2基因为代表,探索节律基因与皮肤衰老之间的关系。同时,探究节律基因PER2与褪黑素受体... 详细信息

[目的]本课题通过探究人真皮成纤维细胞(Primary Dermal Fibroblast,Normal,Human,Adult,HDFa)中节律基因PER2、BMAL1、CRY1随时间周期性变化,并以PER2基因为代表,探索节律基因与皮肤衰老之间的关系。同时,探究节律基因PER2与褪黑素受体1a(Melatonin Receptor 1a,MT1)细胞信号转导通路及相互作用机制,以期为揭示皮肤抗衰分子机制提供新的理论依据。[方法]1.本研究通过RT-PCR法检测地塞米松同步化作用后HDFa 48 h内(间隔8h)节律基因PER2、BMAL1、CRY1周期性节律情况。2.利用小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)干扰节律基因PER2、BMAL1和CRY1,检测基因表达情况。以节律基因PER2为例,检测皮肤衰老相关指标:细胞增殖活力、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平、基质金属酶 1(Matrix metalloproteinasel,MMP1)和 Ⅰ 型胶原(Collagen Type 1,Collagen Ⅰ)的表达,进而探索节律基因与皮肤衰老之间的关系。3.选择MT1受体的内源性配体--褪黑素(Melatonin)作用HDFa后,检测48h内(间隔8 h)PER2节律基因表达情况,同时检测上述皮肤细胞衰老指标:细胞增殖活力、ROS水平、MMP1、collagen Ⅰ的基因及蛋白表达水平变化。4.本研究成功建立了活细胞MT1过表达系统:在293T细胞上过表达MT1受体,褪黑素作用后通过Glosensor检测活细胞cAMP表达同时检测下游蛋白PKA的表达,验证褪黑素和MT1受体结合后能够抑制cAMP/PKA通路。5.使用cAMP/PKA细胞信号转导通路激活剂Forskolin和抑制剂H-89分别作用HDFa后检测PER2、MMP1、collagen Ⅰ的基因及蛋白表达水平,并检测PKA蛋白表达水平。[结果]***中节律基因随时间存在周期性变化:地塞米松作用HDFa后节律基因PER2、BMAL1、CRY1的表达能够拟合为正弦波型图。2.节律基因和皮肤衰老的关系:当转染72 h,小干扰RNA敲低实验中siPER2(p基因表达水平降低显著,证明该敲低模型成立。敲低PER2时,MMP1(p2基因为例,Western Blot验证敲低PER2后细胞内蛋白水平,PER2(p293T细胞中过表达MT1受体,褪黑素作用后Glosensor检测活细胞cAMP出现降低,Western Blot检测下游蛋白PKA(p基因PER2与MT1受体细胞信号转导通路及分子机制:用10 μM Forskolin 作用 HDFa 后能够上调 PER2(p2(p基因的变化情况,随着时间的增加,波幅下降(约为对照组0.8倍),并且褪黑素作用并不会影响PER2的节律周期(约为26 h),也没有引起相位移动,且出现波峰波谷的时间点没有变化。[结论]***2、BAML1、CRY1在HDFa中存在正弦波节律。2.以PER2基因为例,利用siRNA敲低PER2后能够促进MMP1表达并抑制collagen Ⅰ表达,

关键词：皮肤衰老昼夜节律周期2基因褪黑素受体1a 褪黑素

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