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cdk1介导MOF的磷酸化修饰在非小细胞肺癌增殖中的作用研究

CDK1介导MOF的磷酸化修饰在非小细胞肺癌增殖中的作用研究

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作者：叶慧吉林大学

学位级别：硕士

肺癌是世界上最致命的恶性肿瘤之一,大致分为非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer,SCLC)。目前,手术是早期NSCLC患者的首选治疗方法,而对于中晚期NSCLC的治疗则需要综合考虑患者的组织... 详细信息

肺癌是世界上最致命的恶性肿瘤之一,大致分为非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer,SCLC)。目前,手术是早期NSCLC患者的首选治疗方法,而对于中晚期NSCLC的治疗则需要综合考虑患者的组织病理学类型、肿瘤分期、基因突变状态及患者体力状况制定治疗方案,其中,放化疗以及靶向治疗是常见的治疗手段。近年来,随着治疗方法的不断改进,癌症患者的预后有所改善,但NSCLC患者的总生存期仍不容乐观,因此亟待寻找有效的治疗靶点来抑制肺癌细胞的增殖,进而改善患者的生活质量和提高生存率。周期蛋白依赖性激酶cdk1(Cyclin Dependent Kinase 1)在细胞周期中扮演关键角色,当与Cyclin B结合形成复合物时发挥激酶活性,并驱动细胞周期G2→M期的转换。在细胞内,cdk1通过磷酸化蛋白质,可以改变修饰蛋白的结构以及其活性,进而参与细胞内多种生理过程,包括细胞的增殖、迁移和凋亡等。MOF(Males Absent on the First)是组蛋白乙酰转移酶MYST家族成员之一,含有高度保守的HAT(Histone Acetyltransferase)酶结构域。根据研究报道,MOF自身乙酰化修饰可以影响其乙酰化酶活性。但是,有关其他类型翻译后修饰是否也影响其乙酰化酶活性知之甚少,有待深入探讨。我们在前期研究中,对稳定表达Flag-MOF的293T细胞进行免疫沉淀后进行了蛋白质谱分析,并鉴定出cdk1,提示MOF与cdk1之间可能存在相互作用。为此,本研究以肺癌细胞以及HEK-293T细胞为实验对象,利用免疫共沉淀结合免疫印迹实验证实cdk1结合并磷酸化MOF,进一步通过构建点突变体质粒结合生化实验,鉴定MOF的磷酸化位点,最后结合生物功能实验阐明cdk1介导MOF磷酸化修饰在NSCLC增殖中的作用,为NSCLC的治疗提供新的策略。本论文工作总结如下:首先,明确cdk1与MOF相互结合:免疫共沉淀结合免疫印迹实验结果表明cdk1与MOF相互作用,并利用原核细胞表达和纯化的MOF蛋白进行GST-Pull down实验,验证cdk1与MOF蛋白相互结合;同时,细胞免疫荧光染色表明内源cdk1和MOF蛋白都以细胞核分布为主;进一步,Mapping实验及蛋白质模拟分子对接,证实cdk1与MOF的C端结合。其次,明确cdk1磷酸化修饰MOF:利用免疫沉淀实验结合泛磷酸化抗体发现MOF在细胞中存在Thr/Ser磷酸化修饰;当过表达cdk1时,MOF蛋白的磷酸化水平升高,反之,敲低cdk1或加入cdk1抑制剂RO3306时,其磷酸化水平随之降低;随后,利用数据库网站及cdk1的底物共识基序预测了MOF蛋白C端可能的磷酸化修饰位点S348/T418,并结合点突变质粒,证明S348和T418是cdk1介导MOF磷酸化修饰的关键位点,突变这两个位点能够抑制MOF蛋白的HAT酶活性。最后,明确cdk1介导MOF磷酸化修饰参与NSCLC细胞的增殖过程:从TCGA、UALCAN数据库分析发现cdk1及Cyclin B在NSCLC组织中高表达。CCK8及克隆形成实验也证明cdk1抑制剂RO3306能够抑制A549和H1299肺癌细胞的生存活力和增殖能力;进一步,通过CCK8、克隆形成以及Ed U掺入实验证实cdk1介导MOF磷酸化位点的突变能够抑制NSCLC的增殖。综上,本论文通过一系列生物化学与分子生物学实验,首次证明cdk1能够结合并磷酸化MOF的S348和T418位点,而且该位点突变后不仅抑制MOF的HAT酶活性,还可以抑制A549和H1299肺癌细胞的生存活力及克隆形成能力,提示cdk1介导MOF磷酸化修饰位点有望成为治疗NSCLC的新靶点。本研究结果为NSCLC的治疗提供了实验及理论依据。

关键词：蛋白质翻译后修饰组蛋白乙酰基转移酶MOF 周期蛋白依赖性激酶cdk1 非小细胞肺癌细胞增殖

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