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钩藤UrLAMT基因及其启动子的克隆与分析

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2024年第2期52卷 145-154页

作者：李永权刘淼上官黎阳王晓红胡涛唐柳张明生贵州大学生命科学学院山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室贵州贵阳550025 贵州省农业科学院蚕业研究所贵州贵阳550006

【目的】克隆钩藤(Uncaria rhynchophylla)中马钱苷酸甲基转移酶(loganic acid methyltransferase,LAMT)基因及其启动子,对UrLAMT基因的组织表达及其对生物和非生物胁迫的响应进行分析,并对UrLAMT及其启动子的生物信息学进行分析,为进... 详细信息

【目的】克隆钩藤(Uncaria rhynchophylla)中马钱苷酸甲基转移酶(loganic acid methyltransferase,LAMT)基因及其启动子,对UrLAMT基因的组织表达及其对生物和非生物胁迫的响应进行分析,并对UrLAMT及其启动子的生物信息学进行分析,为进一步研究UrLAMT转录调控奠定基础。【方法】基于钩藤的转录组数据设计引物,采用PCR从钩藤cDNA中克隆UrLAMT序列,并对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR,分析UrLAMT在钩藤不同组织(根、茎、叶、花、果实、钩)中的表达,以及对外源茉莉酸甲酯(MeJA)、遮光/复光胁迫的响应;利用FPNI-PCR技术克隆UrLAMT上游启动子序列,并验证其活性,结合酵母单杂交试验,分析相应转录因子与UrLAMT启动子的调控关系。【结果】克隆得到钩藤UrLAMT序列,其长度为1137 bp,共编码378个氨基酸。UrLAMT蛋白质相对分子质量为42.64 ku,理论等电点为5.76,为亲水性蛋白,无信号肽,不含跨膜结构,定位在细胞质中;UrLAMT基因在钩藤叶中表达量最高,其次为根;UrLAMT均能响应MeJA和光;其与短小蛇根草和长春花的进化关系较近。UrLAMT启动子序列长度为1141 bp,除核心响应元件外还含有多个光响应元件,UrLAMT启动子在酵母中与光调控转录因子HY5存在相互作用。【结论】获得了UrLAMT基因及其启动子序列,其在钩藤叶中表达量最高,可能受光诱导。

关键词：钩藤马钱苷酸甲基转移酶基因克隆启动子克隆酵母单杂交

木薯MeCYP79D1和MeCYP79D2基因启动子克隆及表达模式分析

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分子植物育种 2024年第11期22卷 3487-3494页

作者：王昕符东青李瑞梅刘姣郭建春胡新文姚远王亚杰海南大学生命科学学院海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南热带农业资源研究院农业农村部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南省热带农业生物资源保护与利用重点实验室海口571101 海南大学热带作物学院海口570228

MeCYP79D1和MeCYP79D2基因是调控木薯生氰糖苷合成的关键基因,研究其表达特性对低氰木薯改良具有重要意义。为了探究MeCYP79D1和MeCYP79D2基因在SC8木薯品种中的表达模式,本研究克隆获得了SC8木薯品种的MeCYP79D1和MeCYP79D2基因启动子... 详细信息

MeCYP79D1和MeCYP79D2基因是调控木薯生氰糖苷合成的关键基因,研究其表达特性对低氰木薯改良具有重要意义。为了探究MeCYP79D1和MeCYP79D2基因在SC8木薯品种中的表达模式,本研究克隆获得了SC8木薯品种的MeCYP79D1和MeCYP79D2基因启动子,发现它们的启动子上具有ABA、SA、GA、Me JA及生长素等激素响应元件,同时具有低温、干旱、伤害胁迫相关元件。采用ABA、SA、GA3、MeJA、低温处理,证明MeCYP79D1和MeCYP79D2基因表达受激素和低温调控。MeCYP79D1和MeCYP79D2基因主要在须根中表达,其次为嫩叶;在块根发育过程中,MeCYP79D1和MeCYP79D2基因主要在块根形成期和膨大前期表达。此研究结果为解析MeCYP79D1和MeCYP79D2基因表达调控机理提供了新的线索。

关键词：木薯(Manihot esculenta) 启动子克隆基因表达生氰糖苷

沙柳SpsLAZY1a、SpsLAZY1b基因启动子克隆及表达分析

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植物遗传资源学报 2022年第3期23卷 917-925页

作者：刘璐贺玉娇王佳琪郝璞王佳濛于凤强阿拉腾苏和杨海峰内蒙古农业大学林学院呼和浩特010019 鄂尔多斯市林业和草原事业发展中心内蒙古鄂尔多斯017000 鄂尔多斯市造林总场内蒙古鄂尔多斯017000

为研究SpsLAZY1a、SpsLAZY1b基因的表达调控机制,本研究从沙柳中分离了SpsLAZY1a、SpsLAZY1b基因的启动子片段。使用PlantCARE数据库对该启动子片段中顺式作用元件预测显示,SpsLAZY1a和SpsLAZY1b启动子序列中除了包含核心元件CAAT-box和... 详细信息

为研究SpsLAZY1a、SpsLAZY1b基因的表达调控机制,本研究从沙柳中分离了SpsLAZY1a、SpsLAZY1b基因的启动子片段。使用PlantCARE数据库对该启动子片段中顺式作用元件预测显示,SpsLAZY1a和SpsLAZY1b启动子序列中除了包含核心元件CAAT-box和TATA-box外,还含有光、茉莉酸甲酯、脱落酸、低温、乙烯、赤霉素等响应元件。Pro_(SpsLAZY1a)和Pro_(SpsLAZY1b)在烟草中瞬时表达和转基因84K杨中的GUS显色结果表明,Pro_(SpsLAZY1a)和Pro_(SpsLAZY1b)具有启动子活性。对转基因84K杨的GUS酶活检测结果表明,Pro_(SpsLAZY1a)的GUS表达活性强于Pro_(SpsLAZY1b)。对转基因84K杨茎的切片结果显示,蓝色显色反应主要集中于内皮层和韧皮部。上述结果表明,SpsLAZY1a、SpsLAZY1b基因的启动子是非组织特异性表达启动子,并且这两个基因启动子的活性存在差异。本研究结果为解析LAZY基因的上游调控机制提供参考。

关键词：沙柳 LAZY1a LAZY1b 启动子克隆表达分析

木薯MeCYP79D1和MeCYP79D2基因启动子克隆及表达模式分析

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分子植物育种 2023年

作者：王昕符东青李瑞梅刘姣郭建春胡新文姚远王亚杰中国热带农业科学院生物技术研究所海南热带农业资源研究院农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南省热带农业生物资源保护与利用重点实验室海南大学热带作物学院海南大学生命科学学院

MeCYP79D1和MeCYP79D2基因是调控木薯生氰糖苷合成的关键基因，研究其表达特性对低氰木薯改良具有重要意义。为了探究MeCYP79D1和MeCYP79D2基因在SC8木薯品种中的表达模式，本研究克隆获得了SC8木薯品种的MeCYP79D1和MeCYP79D2基因启动... 详细信息

MeCYP79D1和MeCYP79D2基因是调控木薯生氰糖苷合成的关键基因，研究其表达特性对低氰木薯改良具有重要意义。为了探究MeCYP79D1和MeCYP79D2基因在SC8木薯品种中的表达模式，本研究克隆获得了SC8木薯品种的MeCYP79D1和MeCYP79D2基因启动子，发现它们的启动子上具有ABA、SA、GA、MeJA及生长素等激素响应元件，同时具有低温、干旱、伤害胁迫相关元件。采用ABA、SA、GA3、MeJA、低温处理，证明MeCYP79D1和MeCYP79D2基因表达受激素和低温调控。MeCYP79D1和MeCYP79D2基因主要在须根中表达、其次为嫩叶；在块根发育过程中，MeCYP79D1和MeCYP79D2基因主要在块根形成期和膨大前期表达。此研究结果为解析MeCYP79D1和MeCYP79D2基因表达调控机理提供了新的线索。

关键词：木薯启动子克隆基因表达生氰糖苷

苹果质膜水通道蛋白MdPIP1;2启动子的克隆和表达分析

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分子植物育种 2022年

作者：汪晶晶辛苗苗柴双双刘晶莹西北农林科技大学生命科学学院陕西省苹果重点实验室

质膜水通道蛋白在植物生长发育和非生物胁迫反应中发挥重要作用，研究水通道蛋白的启动子对阐明基因功能和抗逆机制有重要意义。本研究利用PCR扩增技术克隆得到了MdPIP1;2基因起始密码子上游1 645 bp长度的启动子序列，通过在线网站Plan... 详细信息

质膜水通道蛋白在植物生长发育和非生物胁迫反应中发挥重要作用，研究水通道蛋白的启动子对阐明基因功能和抗逆机制有重要意义。本研究利用PCR扩增技术克隆得到了MdPIP1;2基因起始密码子上游1 645 bp长度的启动子序列，通过在线网站Plant CARE和PLACE对该序列的顺式作用元件进行了预测和分析，结果表明该启动子含有大量与植物激素调控、光响应和非生物胁迫相关的顺式作用元件。随后通过构建融合表达载体pCAMBIA1301-proMdPIP1;2::GUS，进行烟草叶片的瞬时表达。染色结果显示该启动子能够驱动下游GUS报告基因的表达，并且受到干旱胁迫的强烈诱导。这些发现可为后续研究MdPIP1;2基因功能及其表达调控提供理论基础。

关键词： MdPIP1 2基因启动子克隆瞬时表达表达分析

沙柳SpsLAZY1a、b基因启动子的克隆及表达分析

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沙柳SpsLAZY1a、b基因启动子的克隆及表达分析

作者：刘璐内蒙古农业大学

学位级别：硕士

LAZY1基因是涉及植物重力反应的重要基因,对植物的分枝角度有重要的调节作用。LAZY1基因功能及机制已有一定研究,但有关该基因表达模式的研究较少,且主要在草本植物。因此,深入研究木本植物LAZY1基因的启动子,对于解析该基因的表达模式... 详细信息

LAZY1基因是涉及植物重力反应的重要基因,对植物的分枝角度有重要的调节作用。LAZY1基因功能及机制已有一定研究,但有关该基因表达模式的研究较少,且主要在草本植物。因此,深入研究木本植物LAZY1基因的启动子,对于解析该基因的表达模式及上游调控机制具有重要价值,为后续阐明LAZY1基因的调控机制奠定研究基础。课题组前期由沙柳中克隆获得了SpsLAZY1a和Sps LAZY1b基因的CDS序列,本研究据此克隆了这两个基因的上游启动子序列,预测其包含的顺式作用元件,构建GUS表达载体并进行GUS显色分析,通过5’端缺失构建4个启动子缺失片段的表达载体并转化84K杨,对获得的转基因株系进行GUS组织特异性和表达活性分析,主要结果如下:(1)获得SpsLAZY1a、Sps LAZY1b基因的启动子序列,长度分别为1375 bp和1411 bp。预测发现这两个启动子包含许多相同的顺式作用元件,主要为光响应元件(G-box、Box 4、GATA-motif),茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA-moti、TGACG-motiff),脱落酸响应顺式作用元件ABRE,低温顺式作用元件LTR,乙烯应答元件ERE和赤霉素响应元件P-box。(2)对Pro ::GUS和Pro ::GUS载体的瞬时转化结果和GUS酶活分析结果表明,SpsLAZY1a、Sps LAZY1b启动子都具有启动活性,且SpsLAZY1a启动子的GUS酶活性强于Sps LAZY1b启动子。(3)Pro ::GUS和Pro ::GUS转化84K杨的显色结果表明,Pro 和Pro 在顶芽、茎、叶片和根部均出现蓝色显色反应,茎的切片结果显示,SpsLAZY1a启动子的显色反应主要集中在皮层最内侧的细胞和韧皮部。(4)SpsLAZY1a基因启动子序列5’端缺失的4个表达载体的GUS显色和酶活检测结果表明,启动活性随着片段长度的缺失而逐渐减弱。综上结果表明,SpsLAZY1a、Sps LAZY1b基因的启动子是非组织特异性表达启动子,SpsLAZY1a、Sps LAZY1b基因很可能存在功能分化。SpsLAZY1a基因主要在茎的皮层最内侧的细胞和韧皮部发挥其功能,与植物重力反应存在关联。SpsLAZY1a启动子序列中片段长度的缺失导致其活性降低。本文的研究结果为解析LAZY1基因的上游调控机制提供重要参考。

关键词：沙柳 LAZY1a LAZY1b 启动子克隆表达分析

三色堇VwTyDCs基因及其启动子的克隆与表达活性分析

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三色堇VwTyDCs基因及其启动子的克隆与表达活性分析

作者：饶英贵州大学

学位级别：硕士

植物酪氨酸脱羧酶(TyDC)可将酪氨酸脱羧形成酪胺,被认为在三色堇(Viola×wittrockiana)花色素形成过程中起重要作用。为进一步明确三色堇酪氨酸脱羧基因(VwTyDC)对花色形成的可能机理,本研究对VwTyDC进行了克隆分析,发现除了已知的VwTyD... 详细信息

植物酪氨酸脱羧酶(TyDC)可将酪氨酸脱羧形成酪胺,被认为在三色堇(Viola×wittrockiana)花色素形成过程中起重要作用。为进一步明确三色堇酪氨酸脱羧基因(VwTyDC)对花色形成的可能机理,本研究对VwTyDC进行了克隆分析,发现除了已知的VwTyDC外,还存在新的Ty DC基因,命名为VwTyDC-like。本研究进一步克隆了VwTyDC和VwTyDC-like基因的g DNA序列,并对VwTyDC-like进行了生物信息学分析,通过q RT-PCR技术分析了VwTyDC和VwTyDC-like基因的表达模式,还分离了VwTyDC和VwTyDC-like基因5'端上游启动子序列,对启动子序列上的顺式作用元件进行分析,通过启动子-GUS报告系统分析了启动子表达活性。主要试验结果如下:1.通过基因结构和生物信息学分析可知:VwTyDC和VwTyDC-like基因的g DNA结构均包含2个外显子和1个内含子,VwTyDC-like基因编码区全长1 497 bp,共编码498个氨基酸,蛋白质分子量为54.94 k Da,理论等电点为5.87,不稳定系数为47.97,推测VwTyDC-like为亲水性不稳定蛋白,共有42个蛋白磷酸化位点,不含信号肽和跨膜结构域。氨基酸比对结果表明,三色堇VwTyDC-like蛋白与三色堇VwTyDC蛋白氨基酸序列的同源性高达92.37%,与狗尾草、橡胶树和毛果杨等物种Ty DC的同源性为66.18%。亚细胞定位结果显示VwTyDC和VwTyDC-like均定位在细胞核和细胞膜。2.通过qRT-PCR技术分析VwTyDC和VwTyDC-like基因的表达模式,结果表明,VwTyDC-like与VwTyDC基因在三色堇不同组织器官、花发育的不同时期、不同花色品种及其唇瓣不同区域中的表达模式高度一致,但VwTyDC-like基因的表达量普遍高于VwTyDC。VwTyDC-like与VwTyDC基因均在花瓣中高表达,且在花发育后期(S7)表达量最高。无论三色堇花瓣是否带有花斑,VwTyDC-like与VwTyDC基因的表达量均由花瓣基部向外逐渐递减。两个基因的表达均具有明显的位置效应。3.通过FPNI-PCR和TAIL-PCR方法进行染色体步移,成功分离出VwTyDC和VwTyDC-like基因ATG序列上游的1 201 bp和2 254 bp的5'-侧翼序列。对顺式作用元件的分析表明,VwTyDC-like和VwTyDC基因启动子序列都含有多个核心启动子元件TATA-box和CAAT-box,核心启动子元件的分布和数量表明,分离的VwTyDC-like和VwTyDC基因启动子序列都具有启动活性。VwTyDC-like和VwTyDC基因的启动子区域含有几个相同或相似的顺式作用元件,启动子区域含有对光调控和激素等有响应元件。将分离的启动子序列与报告基因GUS融合构建植物表达载体转化拟南芥,经过GUS组织化学染色检测启动子的表达活性,结果表明,VwTyDC-like和VwTyDC启动子为花特异启动子,且在花瓣中的表达活性具有位置效应,GUS基因荧光定量结果表明VwTyDC-like和VwTyDC启动子在花中具有较高的转录效率。

关键词：三色堇酪氨酸脱羧酶表达模式位置效应启动子克隆花特异性启动子

五味子PLR基因及其启动子的克隆与表达分析

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中草药 2020年第18期51卷 4747-4754页

作者：李海燕刘久石魏如滨王婷刘宇阳王熙昂李宏博沈阳农业大学园艺学院辽宁沈阳110866 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所北京100193

目的从五味子中克隆木脂素生物合成途径松脂醇-落叶松脂素还原酶(Pinoresinol-lariciresinol reductases,PLR)基因及其启动子序列,并进行生物信息学与表达分析。方法根据转录组PLR测序序列设计特异性引物,克隆ScPLR并进行生物信息学分析... 详细信息

目的从五味子中克隆木脂素生物合成途径松脂醇-落叶松脂素还原酶(Pinoresinol-lariciresinol reductases,PLR)基因及其启动子序列,并进行生物信息学与表达分析。方法根据转录组PLR测序序列设计特异性引物,克隆ScPLR并进行生物信息学分析;采用TAIL-PCR对Sc PLR启动子序列扩增,并进行序列分析;采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析果实不同发育时期ScPLR的表达。结果Sc PLR基因开放阅读框(ORF)全长837bp,编码278个氨基酸;ScPLR蛋白相对分子质量31419.85,理论等电点8.97;具有跨膜结构,无信号肽,为稳定性疏水蛋白,主要由α-螺旋和无规卷曲构成;亚细胞定位预测Sc PLR主要定位于细胞质;系统进化显示Sc PLR与蓖麻PLR亲缘关系较近。克隆到Sc PLR基因启动子长994bp,具有TATA-box、CAAT-box基本元件、光调控、生长素响应、厌氧诱导、防御和应激反应的多种调控元件;qRT-PCR结果显示ScPLR表达量呈现果实膨大期快速增加而进入着色期迅速降低的变化趋势。结论获得了Sc PLR基因及其启动子序列,ScPLR果实着色期之前高水平表达的趋势和木脂素的动态变化相一致,为进一步研究该基因功能及表达调控奠定了理论基础。

关键词：五味子 ScPLR 基因克隆启动子克隆表达分析

白菜型冬油菜NCED3基因、启动子的克隆及其表达分析

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干旱地区农业研究 2020年第5期38卷 64-70页

作者：武军艳马骊方彦张亚宏马学才刘丽君牛早霞李学才李爱国孙万仓甘肃农业大学农学院/甘肃省油菜工程技术研究中心甘肃兰州730070 甘肃天水市农业科学研究所甘肃天水741001 河北省农作物抗旱研究实验室河北衡水053000

从2个不同抗寒性的冬油菜品种中克隆了NCED3基因及其启动子序列,并分析其在叶片和根中的表达,研究NCED3基因在冬油菜中的作用机理。结果表明,陇油6号的NCED3基因开放阅读框(ORF)长度为1794 bp,编码597个氨基酸,分子量65.74 kD,理论等电... 详细信息

从2个不同抗寒性的冬油菜品种中克隆了NCED3基因及其启动子序列,并分析其在叶片和根中的表达,研究NCED3基因在冬油菜中的作用机理。结果表明,陇油6号的NCED3基因开放阅读框(ORF)长度为1794 bp,编码597个氨基酸,分子量65.74 kD,理论等电点为5.81;天油2号的ORF与其长度相同,分子量为65.78 kD,理论等电点为5.94。2个蛋白都是亲水蛋白,具有疏水峰。根据预测,启动子具有生物过程中常见的顺式作用元件如CAAT-box等、分生组织表达CAT-box相关的顺式作用元件、-30 TATA box附近的核心启动子元件等,还有ABRE、TGA-element、CGTCA-motif、TGACG-element等激素响应元件,此外,还鉴定出低温响应元件(LTR)。2个品种启动子序列的相似度为99.38%,只有1个不同的顺式作用元件,即circadian,推测其与昼夜节律相关。低温、PEG及ABA处理后NCED3在叶片和根中的表达均高于对照,增加范围为0.07~6.48,且均于8 h达到峰值。与根系的表达特性相比,胁迫处理后叶片的基因表达均在2 h显著升高,天油2号的升高幅度(1.54~6.00)均大于陇油6号(0.04~1.95)。

关键词： NCED3基因白菜型冬油菜抗寒性启动子克隆序列分析胁迫基因相对表达量