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大肠杆菌异源生产丁醇途径组装及启动子优化

生物工程学报 2012年第11期28卷 1328-1336页

作者：唐玮李键陈军杨晟中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所中国科学院合成生物学重点实验室上海200032

启动子优化是合成生物学研究的重要工具,可以通过不同强度的启动子调控基因转录水平以优化生物途径。丁醇是一种多用途的基础化工原料,目前有很多代谢工程手段应用在大肠杆菌的丁醇异源表达中,但是并没有进行启动子的精细调控。文中以... 详细信息

启动子优化是合成生物学研究的重要工具,可以通过不同强度的启动子调控基因转录水平以优化生物途径。丁醇是一种多用途的基础化工原料,目前有很多代谢工程手段应用在大肠杆菌的丁醇异源表达中,但是并没有进行启动子的精细调控。文中以大肠杆菌为宿主构建异源丁醇合成途径,通过DNA assembler的方法一步组装不同强度启动子组合的丁醇合成途径以优化丁醇合成。以强启动子Alper PLTetO1或弱启动子Alper BB转录硫解酶,以强启动子Braatsch 20或弱启动子Braatsch 10转录丁醇合成操纵子,共构建成4种不同质粒。结果表明以AlperPLTetO1转录硫解酶,Braatsch 10转录丁醇合成操纵子的组合获得最高的丁醇产量28 mg/L,与其他组合相比丁醇产量提高了3~5倍。

关键词：快速组装启动子优化丁醇

硫模块启动子对提高L-甲硫氨酸的生物合成的影响及发酵培养条件的优化

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食品与发酵工业 2019年第19期45卷 8-16页

作者：金利群金伟熔柳志强浙江省生物有机合成技术研究重点实验室(浙江工业大学) 浙江杭州310014 生物转化与生物净化教育部工程研究中心(浙江工业大学) 浙江杭州310014 手性生物制造国家地方联合工程研究中心(浙江工业大学) 浙江杭州310014

研究生物合成硫模块对L-甲硫氨酸产量的影响并优化了发酵条件。利用实验室构建的重组菌株,用trc启动子替换基因组上cysK的组成型启动子,在质粒pA*H上插入glpE和nrdH基因;通过构建PG3启动子文库,获得转录强度最高的p32启动子,进一步优化... 详细信息

研究生物合成硫模块对L-甲硫氨酸产量的影响并优化了发酵条件。利用实验室构建的重组菌株,用trc启动子替换基因组上cysK的组成型启动子,在质粒pA*H上插入glpE和nrdH基因;通过构建PG3启动子文库,获得转录强度最高的p32启动子,进一步优化硫模块,最后通过对培养基的优化提高了硫代硫酸盐的供给,从而提高L-甲硫氨酸产量。结果表明:使用构建得到的E.coli W3110 JAHFEBL trc-cysK/pA*H-p32-nrdH-glpE菌株,发酵48 h后L-甲硫氨酸摇瓶水平产量达到1.3 g/L,较对照组提升了41.5%;通过对培养基的进一步优化,L-甲硫氨酸产量最终达到2.3 g/L,相比未优化的发酵水平提高了77.0%,且该研究为其他含硫氨基酸的生物合成提供了基础。

关键词： L-甲硫氨酸启动子优化硫同化模块生物合成硫代硫酸盐

玉米赤霉烯酮降解酶基因表达的启动子优化研究

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玉米赤霉烯酮降解酶基因表达的启动子优化研究

作者：周艳敬河南工业大学

学位级别：硕士

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是一种由镰刀菌产生的真菌毒素,它广泛污染小麦、玉米、高粱等谷物及其制品,具有雌激素作用,主要作用于生殖系统,严重危害人畜健康和生命安全。在前期研究中,本实验室已构建了ZEN降解酶基因ZLHY6由强启动... 详细信息

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是一种由镰刀菌产生的真菌毒素,它广泛污染小麦、玉米、高粱等谷物及其制品,具有雌激素作用,主要作用于生殖系统,严重危害人畜健康和生命安全。在前期研究中,本实验室已构建了ZEN降解酶基因ZLHY6由强启动子P43介导的表达载体,并获得了该基因在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中的早期外分泌表达重组子Z1。本课题对工程菌Z1进行了启动子优化,并比较了优化前后启动子调控的表达水平及降解酶活性,得到的主要研究结果如下:1.利用生物信息学方法分析并合成了PlapS启动子片段,将该片段与启动子P43定向替换,构建了表达载体pWBZ7,经过分子生物学鉴定,得到了PlapS启动子介导的早期外分泌表达重组子Z7。2.通过对ZEN降解酶基因ZLHY6的表达水平及降解酶活性的比较,评价了两种组成型启动子P43与PlapS的调控表达效果。将启动子P43与PlapS分别对应的Z1和Z7工程菌在相同条件下发酵培养,并在不同时间取样测定ZEN降解酶活性。结果表明,在发酵10 h-35 h过程中,Z7的降解酶活性较Z1均有明显提高,而且都在12 h达到最高值,分别为219.02 U·mL-1和99.6 U·mL-1。工程菌Z1、Z7样品发酵液的SDS-PAGE和Western Blot分析结果与酶活结果一致;对重组质粒的稳定性分析表明,启动子PlapS介导的ZEN降解酶基因表达载体pWBZ7可以在Bs 168中稳定遗传。3.初步评价了Z7对玉米副产物中ZEN的降解效果。在最适酶活条件下,工程菌Z7的降解酶发酵液处理玉米醪、DDGS 12 h后,上述样品中ZEN的降解率达到90%以上,并完成了降解酶对玉米醪和DDGS中ZEN的脱毒工艺的初步研究。利用20 L发酵罐对Z7进行放大发酵,通过批次实验,获得了使酶高效分泌表达的技术参数,为后续工业化应用提供技术支撑。

关键词：玉米赤霉烯酮枯草芽孢杆菌启动子优化高效表达

基于启动子优化改进Tri-SUS系统用于植物钾吸收的研究

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基于启动子优化改进Tri-SUS系统用于植物钾吸收的研究

作者：史雨欣山西大学

学位级别：硕士

钾离子在植物的信号传导,生物胁迫等很多生理功能中发挥了很重要的作用。对钾离子吸收,特别是钾离子通道门控机制的了解,可以为农作物相关性状研究奠定基础,也为缓解未来可能出现的粮食短缺提供一条可行的思路。SNARE(可溶性N-乙基马来... 详细信息

钾离子在植物的信号传导,生物胁迫等很多生理功能中发挥了很重要的作用。对钾离子吸收,特别是钾离子通道门控机制的了解,可以为农作物相关性状研究奠定基础,也为缓解未来可能出现的粮食短缺提供一条可行的思路。SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感附着蛋白受体)蛋白通过形成SNARE复合物完成植物膜运输的最终膜融合步骤。除了膜融合中的作用外,SNARE蛋白还从亚细胞定位及通道门控活性等层面调节离子通道的功能。拟南芥SNARE蛋白SYP121和VAMP721都能与电压门控钾离子通道相互作用,前者影响钾离子通道的亚细胞定位并通过蛋白互作直接促进其通道活性,而后者则抑制通道活性。蛋白互作是生物体生理活动基础,因此,检测蛋白质-蛋白质相互作用对于揭示个体细胞过程背后的调控机制至关重要。常规方法如Pull-Down、荧光能量共振转移、双分子荧光互补法等一般检测一对一互作,不能提供足够的信息来阐明活细胞中的多组分相互作用,而实际上细胞内完成生理活动往往是多个蛋白互作的结果。本实验室前期从基于杂交的酵母分裂泛素化系统出发,构建了Tri-SUS系统,可用于三蛋白互作研究。Tri-SUS系统中,诱饵蛋白和猎物蛋白通过组成型启动子p TDH3控制,而第三蛋白由pmet25启动子控制受甲硫氨酸浓度负向调控,这一改进实现了三蛋白互作。但由于蛋白水平对酵母实验结果的影响,是否改变启动子强度会影响蛋白互作检测结果值得探究。因此,本研究在原有Tri-SUS体系中进行了启动子的优化,选取另外两种组成型启动子p CHO1、p CYC1替换p TDH3,以及不同的铁离子浓度负向调控诱导型启动子p FET3替换pmet25,获得Tri-SUS系列载体,并用于研究钾离子通道亚基KC1与VAMP721/SYP121的互作关系。对Tri-SUS系统的改进,也将为生物学研究提供一个强有力的研究工具。更换诱饵蛋白启动子表明,在相对弱启动子调控下,减弱诱饵蛋白KC1的表达量后,在SYP121作为第三蛋白介导下,原本与钾通道无法互作的VAMP721突变体通过实验显示结合。表明更换启动子对于进一步改进Tri-SUS系统有意义而在改变为p FET3启动子调控第三蛋白表达后,SYP121作为猎物蛋白,VAMP721作为第三蛋白,可以看到仅在低浓度铁存在下,酵母微弱生长。对此现象,其中一个解释是p FET3与pmet25启动子本底调控表达作用不同。大量存在的VAMP721竞争性与钾通道互作,影响作为猎物蛋白的SYP121结合,从而抑制酵母生长。

关键词：钾离子通道 SNARE SYP121 VAMP721 VAMP721Y57D Tri-SUS法启动子优化

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豆血红蛋白在酿酒酵母中的异源表达

食品工业科技 2023年第20期44卷 101-107页

作者：薛常鲁张鹏飞白丽君肖功年魏培莲浙江科技学院生物与化学工程学院浙江杭州310023 浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室浙江杭州310023

豆血红蛋白是一种植物源血红蛋白,在植物蛋白肉加工中可作为重要的风味催化剂和着色剂,大大增加植物蛋白肉的拟真性。为实现豆血红蛋白在食品级微生物中的异源表达,将携带豆血红蛋白LBC2基因的质粒PESC-TRP转入酿酒酵母CEN.PK2-1C中,通... 详细信息

豆血红蛋白是一种植物源血红蛋白,在植物蛋白肉加工中可作为重要的风味催化剂和着色剂,大大增加植物蛋白肉的拟真性。为实现豆血红蛋白在食品级微生物中的异源表达,将携带豆血红蛋白LBC2基因的质粒PESC-TRP转入酿酒酵母CEN.PK2-1C中,通过添加kozak序列促进其翻译,并进一步对启动子序列进行选择,以提高豆血红蛋白表达量。对重组菌株进行发酵,用Western blot分析LegH蛋白表达水平。结果显示,诱导型启动子GAL1,10较三种组成型启动子TEF1、ADH1、GAP在表达LegH能力上具有显著优势,较产量最低的ADH1启动子提升了3.93倍。在组成型启动子中,TEF1启动子能力较优,是ADH1启动子的2.91倍,是GAP启动子的1.2倍。最后,利用Ni柱亲和层析对蛋白进行浓缩纯化,测得LegH发酵浓度为2.79 mg/L。本研究成功实现了豆血红蛋白在酿酒酵母中的异源表达,经后续优化有可能成为豆血红蛋白异源表达的又一途径。

关键词：酿酒酵母豆血红蛋白启动子优化异源表达蛋白质印迹

基于异戊烯基焦磷酸异构酶的改造及表达优化提高异戊二烯产量

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食品与发酵工业 2023年第21期49卷 1-8页

作者：孙瓅刘春立刘秀霞李业杨艳坤白仲虎江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

异戊二烯是最简单的萜烯类化合物,是橡胶、食品、医药和化妆品工业的重要原料。在微生物中构建甲羟戊酸(mevalonate,MVA)代谢途径是目前生产异戊二烯及其衍生萜烯的有效途径,但关键酶的活性和表达水平会限制异戊二烯的合成。针对关键酶... 详细信息

异戊二烯是最简单的萜烯类化合物,是橡胶、食品、医药和化妆品工业的重要原料。在微生物中构建甲羟戊酸(mevalonate,MVA)代谢途径是目前生产异戊二烯及其衍生萜烯的有效途径,但关键酶的活性和表达水平会限制异戊二烯的合成。针对关键酶-异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)的活性低等问题,该研究从酶工程、启动子工程和核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)工程3个方面对IDI的表达进行了优化。首先在大肠杆菌中建立了异戊二烯生产体系,挑选肺炎链球菌来源的IDI进行蛋白质建模和结构分析,计算得到了活性热点Met146并对其进行点突变。经过改造得到1株突变体Met146His,其将异戊二烯的产量提升至820.46 mg/L。接着针对该突变株进行启动子优化和RBS优化,最终得到的优化菌株将异戊二烯的产量提升至862.79 mg/L,是出发菌株的2.58倍。结果证明,对于IDI进行酶分子改造和表达优化以提高酶活性并调控表达水平,是提高异戊二烯产量的有效策略。IDI的优化也可以应用于异戊二烯的下游产物,如倍半萜和二萜等的生物合成。

关键词：异戊烯基焦磷酸异构酶理性设计启动子优化核糖体结合位点优化异戊二烯

麦芽糖淀粉酶amyM在枯草芽孢杆菌中的重组表达优化及应用研究

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麦芽糖淀粉酶amyM在枯草芽孢杆菌中的重组表达优化及应用研究

作者：陈玉丹华南理工大学

学位级别：硕士

麦芽糖淀粉酶(EC3.***.1.133)是一种可以水解α-(1,4)和α-(1,6)糖苷键,在以淀粉、麦芽三糖及糊精等为底物时,终产物为大量麦芽糖和少量葡萄糖的淀粉酶。由于具有独特的催化性质以及多底物特性,麦芽糖淀粉酶在淀粉糖化、面粉改性、烘焙食... 详细信息

麦芽糖淀粉酶(EC3.***.1.133)是一种可以水解α-(1,4)和α-(1,6)糖苷键,在以淀粉、麦芽三糖及糊精等为底物时,终产物为大量麦芽糖和少量葡萄糖的淀粉酶。由于具有独特的催化性质以及多底物特性,麦芽糖淀粉酶在淀粉糖化、面粉改性、烘焙食品保鲜和制备麦芽糖浆等领域具有应用优势。本研究选取来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的麦芽糖淀粉酶基因作为研究对象,通过提高目的基因转录水平、优化目的蛋白分泌途径和改善细胞代谢活力等手段显著提高了amyM在枯草芽孢杆菌中的异源表达水平。此外,在对纯化酶的酶学性质进行测定和应用研究后发现该酶具有优良的热稳定性和pH稳定性,并且在改善面团粘弹性和面包的保鲜中发挥良好的作用效果。本论文的主要研究结论如下:(1)最佳启动子的筛选。构建了7种含不同启动子组合的amyM重组表达质粒:PB E-P43-amyM-SamyQ、PBE-Pcd-P43-amyM-SamyQ、PBE-PamyL-P43-amyM-SamyQ、PB E-PamyS-P43-amyM-SamyQ、PBE-PamyE-PamyL-amyM-SamyQ、PBE-PamyS-PamyL-a myM-SamyQ和PBE-PamyE-Pamy S-PamyL-amyM-S amyQ。将以上重组质粒分别转入枯草芽孢杆菌WB800-ΔamyE宿主中进行表达。通过酶活测定比较发现将来源于地衣芽孢杆菌淀粉酶的启动子PamyL串联一个P43启动子组成的双启动子PamyL-P43对amyM的重组表达效果最好。在50 mL的TB培养基中,33℃发酵72小时酶活达到最高,为198.73 U/mL,比单启动子P43提高了61.25%。(2)amyM分泌途径的优化和细胞代谢活力的提高。基于CRISPRCas9基因编辑技术构建了一个敲除质粒pWSCas9n-ΔsrfAC及三个整合质粒pWSCas9n-PamyX-prsA、pW SCas9n-P43-prsA和pWSCas9n-P43-vgb,用以单独敲除srfAC基因和在srfAC位点上分别整合prsA基因和vgb基因。经过编辑后得到WB800-ΔsrfAC、WB800-PamyX-prsA、WB 800-P43-prsA和WB800-P43-vgb四个宿主菌株。以PBE-P43-amyM-SamyQ为基础质粒,分别转入上述四个宿主菌中,通过发酵验证各菌株表达效果。研究发现WB800-ΔsrfAC菌株酶活比野生型菌株中提高了 16.75%;WB800-PamyX-prsA菌株中prsA和amyM基因的转录量高于野生型菌株,但是amyM的胞外酶活没有明显提高;WB 800-P43-prsA菌株中prsA和amyM转录量最高,且经过SDS-PAGE验证此株菌胞内没有amyM包涵体,胞外酶活达到363.97 U/mL,比野生型菌株提高了101.58%。WB800-P43-vgb菌株细胞内的N ADP+和NADPH含量显著高于野生型菌株,说明菌株内细胞代谢活力得到明显提高,表现在amyM转录量显著高于野生型菌株,且胞外酶活达到554.43 U/mL,比野生型菌株提高了204.08%。(3)amyM的分子改造。通过Discovery Studio软件对PDB数据库中AmyM与阿卡波糖的对接模型进行丙氨酸扫描和饱和突变,确定了 14个突变位点(Glu256Lys,Glu256Trp,Glu256Phe,Glu256Tyr,Phe188Trp,His232Tyr,His90Trp,Tyr258Trp,Leu196Phe,Glu256Gln,Glu256His,Glu256Met,Glu256Arg,His90Phe),最终筛选出Y258 W突变体,酶活力与天然酶相当,但是催化活性发生了改变。通过测定反应体系中淀粉底物的剩余量、产物麦芽糖和葡萄糖的含量,发现突变酶的添加会导致麦芽糖含量下降,可能是增加了酶的转苷作用所致;但是葡萄糖和麦芽糖总含量高于天然酶反应体系中,推测突变酶会减少反应体系中糊精等其他副产物的产生,使淀粉底物更多地水解为麦芽糖和葡萄糖,该突变体有利于减少反应体系中副产物的产生。(4)AmyM的纯化、酶学性质测定和应用研究。在测定AmyM的酶学性质时发现该酶最适反应温度为65℃,最适反应pH为5.5,且具有良好的热稳定性和pH稳定性。将纯化酶应用于面团的制作中发现,添加量为40 mg/kg和80 mg/kg时,面团的粘性和弹性均得到了很大程度的改善,在添加40 mg/kg时效果更好,面团的粘弹性最高为空白对照组的4.6倍。将纯化酶添加到面包制作中,通过测定储存第3、5和7天面包的硬度、弹性、咀嚼性、内聚性和老化焓值时发现,AmyM的添加使这些评定面包品质的性质全部优于空白对照组,即AmyM在面包保鲜中具有良好的效果。尤其是在降低面包硬度、咀嚼性和老化焓值时,Am

关键词：麦芽糖淀粉酶amyM 枯草芽孢杆菌启动子优化 prsA分子伴侣透明颤菌血红蛋白基因vgb

长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的重组表达及条件优化

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长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的重组表达及条件优化

作者：宋皖江南大学

学位级别：硕士

长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)来源的普鲁兰酶具有优良酶学性质,并适合淀粉糖化过程中高温、耐酸特点的要求,能够提高淀粉利用率,加速糖化过程,在以淀粉为原料的工业中具有很高的应用价值。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是公... 详细信息

长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)来源的普鲁兰酶具有优良酶学性质,并适合淀粉糖化过程中高温、耐酸特点的要求,能够提高淀粉利用率,加速糖化过程,在以淀粉为原料的工业中具有很高的应用价值。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是公认安全(GRAS)菌株,且可将具有活性的天然蛋白直接分泌到培养基中。因此,本研究利用枯草芽孢杆菌成功表达了长野芽孢杆菌来源的普鲁兰酶,并通过启动子和宿主的优化,组成型表达系统的稳定性分析以及诱导型表达系统的构建和优化,不仅在枯草芽孢杆菌中实现并提高了普鲁兰酶的胞外表达,为解决国内对进口普鲁兰酶的依赖问题提供有价值的菌株,也为枯草芽孢杆菌有效表达其他外源蛋白提供了思路。主要内容如下:(1)以长野芽孢杆菌基因组为模板,通过PCR方法扩增出普鲁兰酶基因pul,并将其克隆到穿梭载体pMA0911上,将构建的重组表达载体pMA0911-PHpaII-pul电转化B.subtilis WB800,从而构建出重组菌B.subtilis WB800/pMA0911-PHpaII-pul;对其发酵上清液的SDS-PAGE分析结果显示,在110 kDa有目的条带且发酵60 h后重组菌的胞外普鲁兰酶活性为3.9 U?m L-1,说明具有生物活性的普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中成功表达并被分泌到胞外。(2)通过使用强启动子P43替换原有启动子PHpa II,重组菌B.subtilis WB800/pMA0911-P43-pul胞外酶活提高到8.7 U?mL-1,是原始菌株的2.23倍;将构建的表达载体转化宿主菌B.subtilis WB600,得到的重组菌B.subtilis WB600/pMA0911-PHpaII-pul和B.subtilis WB600/pMA0911-P43-pul的胞外酶活分别达到21.3 U?m L-1和24.5 U?m L-1,分别是原始菌株的5.46和6.28,说明P43启动子和宿主菌B.subtilis WB600更适合普鲁兰酶的有效表达。(3)对构建的四株组成型重组菌在发酵产酶过程中的质粒稳定性进行研究,发现低产菌株B.subtilis WB800/pMA0911-PHpaII-pul和B.subtilis WB800/pMA0911-P43-pul不存在质粒丢失现象,而表达量较高的重组菌B.subtilis WB600/p MA0911-PHpa II-pul和B.subtilis WB600/pMA0911-P43-pul在发酵产酶过程中质粒会变得不稳定而丢失,说明了普鲁兰酶的高负荷表达使重组菌的质粒发生丢失,可以通过补加抗生物作为选择压力以避免质粒的丢失;此外,胞外普鲁兰酶活性最高的重组菌B.subtilis WB600/pMA0911-P43-pul在传代50次后,仍然表现出结构稳定性。(4)使用蔗糖诱导型启动子PsacB替换原有启动子PHpa II,构建了普鲁兰酶的蔗糖诱导表达系统B.subtilis WB800/pMA0911-PsacB-pul,其胞外酶活为2.5 U?m L-1;通过宿主菌和蔗糖诱导条件的优化,B.subtilis WB600/pMA0911-PsacB-pul在蔗糖终浓度为3%(w?v-1),诱导温度为20℃,当菌体浓度OD600为0.3时进行诱导,胞外酶活最高达到10.6 U?m L-1,是优化前重组菌B.subtilis WB800/pMA0911-PsacB-pul胞外酶活的4.24倍。

关键词：长野芽孢杆菌普鲁兰酶枯草芽孢杆菌启动子优化宿主质粒稳定性

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产虫草素酿酒酵母工程菌株的构建与优化

产虫草素酿酒酵母工程菌株的构建与优化

作者：霍春红大连工业大学

学位级别：硕士

虫草素(cordycepin),又名3’-脱氧腺苷(3’-deoxyadenosine),于1951年首次被Cunningham等人从蛹虫草Cordyceps militaris发酵液中分离得到,其不仅能够抑制病毒的RNA合成,而且对HIV-I型病毒以及肺癌、乳腺癌等十余种癌症均有较好疗效。... 详细信息

虫草素(cordycepin),又名3’-脱氧腺苷(3’-deoxyadenosine),于1951年首次被Cunningham等人从蛹虫草Cordyceps militaris发酵液中分离得到,其不仅能够抑制病毒的RNA合成,而且对HIV-I型病毒以及肺癌、乳腺癌等十余种癌症均有较好疗效。虫草素获取途径主要包括化学合成法和生物法,目前,虫草素大多源自蛹虫草C.militaris液体发酵,但蛹虫草发酵周期长(15-60 d),生产强度低,导致虫草素价格昂贵,极大限制了虫草素的大规模应用。本研究以发酵周期短、遗传背景清晰、生物安全的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C为底盘细胞,选择源自蛹虫草C.militaris CM01的虫草素合成关键基因Cns1和Cns2,经密码子优化后得到Sc CNS1和Sc CNS2,在酿酒酵母S.cerevisiae S288C中实现虫草素合成关键基因的异源表达。随后,分别选取组成型启动子P、P、P和诱导型启动子P、P对工程菌的启动子元件进行改造,经摇瓶液体发酵筛选后成功筛选得到3株性能优良酵母工程菌SHC02、SHC03和SHC04,其中,工程菌SHC02液体发酵240 h虫草素产量可达67.32 mg/L。进一步,本研究对发酵性能优异的酵母工程菌SHC02进行深层液体发酵,分析其关键基因(ZWF1、PRS4、ADE4、Sc CNS1及Sc CNS2)的表达情况,并优化了发酵培养基中碳源、氮源、前体以及金属离子等组分,确定以50 g/L葡萄糖为初始底物结合一次补料、添加1 mmol/L Cu和1.0 g/L腺嘌呤为最适培养基组成,其中添加1 mmol/L Cu虫草素产量最高,可达266.47 mg/L,较对照组提高145.67%。最后,本研究对胞内虫草素的储存场所脂滴进行了改造,使虫草素更多储存于细胞内,以降低发酵液中高浓度虫草素对细胞的毒害作用,通过对调控酵母细胞脂滴大小的LDP1基因过表达,得到了酵母工程菌SHC07,然而发酵液当中未检测到虫草素,推测LDP1可能更多参与脂代谢,对虫草素生产无明显影响。本研究结果将为进一步实现酿酒酵母工程菌液体发酵体系高效生产虫草素奠定基础。

关键词：酿酒酵母虫草素启动子优化脂滴改造发酵优化