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中国医学科学院学报 2019年第4期41卷 536-540页

作者：李奇杨俊杨简杨英三峡大学第一临床医学院心内科心血管病研究所

细胞凋亡在维持机体正常发育以及内环境稳定中发挥重要作用,同时也对多种疾病的病理生理产生影响。研究表明心肌细胞凋亡参与了多种心血管疾病的发生发展过程。含胱天蛋白酶富集功能域凋亡抑制因子(ARC)是迄今为止唯一在心脏特异性高表... 详细信息

细胞凋亡在维持机体正常发育以及内环境稳定中发挥重要作用,同时也对多种疾病的病理生理产生影响。研究表明心肌细胞凋亡参与了多种心血管疾病的发生发展过程。含胱天蛋白酶富集功能域凋亡抑制因子(ARC)是迄今为止唯一在心脏特异性高表达的抗凋亡蛋白,并可通过其抗凋亡能力发挥心肌保护作用。本文就ARC的结构和特点、ARC在心血管疾病中的作用及机制予以综述。

关键词：含胱天蛋白酶富集功能域凋亡抑制因子凋亡心血管疾病

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miR-327调控凋亡抑制因子ARC在心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制研究

miR-327调控凋亡抑制因子ARC在心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制...

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作者：李奇三峡大学

学位级别：硕士

目的:凋亡反应是心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）的关键环节,抑制心肌细胞凋亡可有效减轻MI/RI,本实验拟通过mi R-327重组腺病毒载体转染H9C2心肌细胞与大鼠心肌组织,研究mi R-327对MI/RI诱导的心肌细胞凋亡的作用,并进一步探讨其通过调控... 详细信息

目的:凋亡反应是心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）的关键环节,抑制心肌细胞凋亡可有效减轻MI/RI,本实验拟通过mi R-327重组腺病毒载体转染H9C2心肌细胞与大鼠心肌组织,研究mi R-327对MI/RI诱导的心肌细胞凋亡的作用,并进一步探讨其通过调控凋亡抑制因子（ARC）等相关信号通路对MI/RI的影响,为防治MI/RI提供理论依据和新的治疗靶点。方法:（1）细胞实验:培养H9C2大鼠心肌细胞,随机分成5组:空白对照组（control组）,缺氧复氧组（H/R组）、腺病毒空载组（Ad-EGFP-NC+H/R,Ad-NC组）、mi R-327上调组（Ad-mi R-327+H/R,Ad-mi R-327组）、mi R-327下调组（Ad-mi R-327-RNAi+H/R,Ad-mi R-327i组）。将重组腺病毒载体转染H9C2心肌细胞48 h后,建立心肌缺氧复氧（H/R）损伤模型（缺氧4 h,复氧12 h）。采用荧光显微镜和流式细胞仪测定腺病毒转染效率;CCK-8法检测细胞存活率;全自动生化分析仪检测培养液中乳酸脱氢酶（LDH）释放水平;流式细胞仪检测凋亡率;实时荧光定量PCR（q PCR）法测定mi R-327与ARC的m RNA含量;Western blot法检测ARC、内源性以及外源性凋亡级联反应cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Caspase-8、Cyt-c、Bax、Bcl-2、Fas以及Fas L蛋白表达水平;双荧光素报告基因检测验证mi R-327与ARC的靶向作用关系。（2）动物实验:将70只雄性SD大鼠随机分为假手术组（sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、腺病毒空载组（Ad-EGFP-NC+I/R,Ad-NC组）、mi R-327上调组（Ad-mi R-327+I/R,Ad-mi R-327组）、mi R-327下调组（Ad-mi R-327-RNAi+I/R,Ad-mi R-327i组）。病毒液或等量生理盐水心肌多点注射72 h后,冠状动脉左前降支缺血30 min再灌注3 h构建MI/RI模型。荧光显微镜观察心肌组织腺病毒转染情况;TTC染色法检测各组大鼠心肌梗死面积比;TUNEL染色检测各组心肌组织凋亡指数;血清检测LDH含量;q PCR法测定mi R-327与ARC的m RNA含量;Western blot法检测心肌组织ARC、内源性以及外源性凋亡级联反应cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Caspase-8、Cyt-c、Bax、Bcl-2、Fas以及Fas L蛋白表达水平。结果:1.细胞实验:（1）H/R刺激后H9C2细胞中mi R-327和ARC表达变化:与Control组相比,H/R组心肌细胞中mi R-327表达显著上升,ARC表达显著下降（P＜0.05）。（2）腺病毒成功转染至H9C2细胞:转染48 h后,荧光显微镜下可见明显的绿色荧光蛋白,并确定MOI=50为最佳感染复数。（3）mi R-327下调抑制H/R诱导的心肌细胞损伤及凋亡反应:与Ad-NC组相比,Ad-mi R-327i组mi R-327表达明显降低,心肌细胞存活率显著上升,凋亡率、LDH释放以及cleaved Caspase-3表达明显减少;Ad-mi R-327组mi R-327表达明显上升,心肌细胞存活率显著降低,凋亡率、LDH释放以及cleaved Caspase-3表达增加（以上P＜0.05）。（4）mi R-327下调可抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡级联反应:与Control组相比,H/R组内源性与外源性凋亡级联反应中促凋亡分子cleaved Caspase-9、Caspase-8、Cyt-c、Bax、Fas、Fas L表达均明显增加,抗凋亡分子Bcl-2表达明显减少;与Ad-NC组相比,Ad-mi R-327i组内源性与外源性凋亡级联反应中促凋亡分子表达明显减少,抗凋亡分子表达明显增加;而Ad-mi R-327组中上述分子表达呈相反效应（以上P＜0.05）。（5）mi R-327靶向调控ARC表达:与Ad-NC组相比,Ad-mi R-327i组ARC蛋白水平显著升高,Ad-mi R-327组ARC蛋白水平显著下降,而ARC的m RNA表达水平未见明显变化;双荧光素酶报告基因结果显示,mi R-327与ARC3′UTR存在特异性结合（以上P＜0.05）。2.动物实验:（1）成功建立大鼠MI/RI模型:与sham组相比,I/R组mi R-327表达明显上升,ARC表达明显下降（P＜0.05）。（2）腺病毒成功转染大鼠心肌组织:转染72 h后,荧光显微镜下可见Ad-NC组,Ad-mi R-327组和Ad-mi R-327i组均存在明显的GFP表达。（3）mi R-327调控MI/RI后心肌组织中ARC的表达:与Ad-NC组相比,Ad-mi

关键词： mi R-327 含胱天蛋白酶富集功能域凋亡抑制因子 H9C2心肌细胞凋亡反应心肌缺血再灌注损伤

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