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吡咯啉-5-羧酸还原酶1调控非小细胞肺癌细胞增殖及转移的机制研究

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吡咯啉-5-羧酸还原酶1调控非小细胞肺癌细胞增殖及转移的机制研究

作者：桑森骅广西大学

学位级别：硕士

研究目的肺癌的高发病率和高死亡率使其成为威胁人类健康的主要疾病,其中约85%的肺癌是非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）。吡咯啉-5-羧酸还原酶1（Pyrroline-5-carboxylate reductase 1,PYCR1）参与脯氨酸代谢,催化吡... 详细信息

研究目的肺癌的高发病率和高死亡率使其成为威胁人类健康的主要疾病,其中约85%的肺癌是非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）。吡咯啉-5-羧酸还原酶1（Pyrroline-5-carboxylate reductase 1,PYCR1）参与脯氨酸代谢,催化吡咯啉-5-羧酸还原为脯氨酸,脯氨酸的代谢在肿瘤的发生中非常重要。前人的研究发现,PYCR1在多种恶性肿瘤中呈现高表达,在前列腺癌细胞中敲除PYCR1能够显著抑制细胞生长和克隆形成,抑制PYCR1表达的乳腺癌细胞的侵袭性减弱,在食管鳞癌中与PYCR1形成的蛋白质复合物可以调控肿瘤细胞的增殖及转移。然而,PYCR1在NSCLC中的功能研究还不多,本研究旨在揭示PYCR1对NSCLC肿瘤学特性的调控及其对上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）信号通路的影响。研究方法1.分析数据库信息得到肺癌中PYCR1的m RNA表达情况,并进一步分析了不同类型肺癌中PYCR1的m RNA表达情况,同时,对PYCR1表达量的高低与患者生存的情况进行分析。通过免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）检测NSCLC组织及相应癌旁组织中PYCR1的蛋白表达情况。2.通过Western blot检测五种常见NSCLC细胞株中PYCR1的表达情况。设计sh RNA敲减95C及H1299细胞中PYCR1的表达,构建敲减细胞株,然后利用实时荧光定量PCR（RT-q PCR）和Western blot验证敲减效率。3.体外分析PYCR1对NSCLC细胞生物学特性的影响。在稳定敲减PYCR1的95C及H1299细胞株中,应用MTT和细胞克隆形成实验检测细胞的恶性增殖特性,应用细胞划痕实验判断细胞增殖速率及迁移的特性,应用Annexin V/DAPI双染色法结合流式细胞术检测细胞凋亡情况,应用PI染色法检测细胞分裂各个时期分布变化。4.研究PYCR1在NSCLC中起作用的具体机制。检测PYCR1对NSCLC细胞迁移和侵袭的影响,研究PYCR1对肿瘤细胞的原位增殖能力及恶性肿瘤细胞迁移的调控作用。通过Western blot研究EMT信号通路的变化。研究结果1.通过分析数据库信息我们发现PYCR1在肺癌中呈现高表达,并且通过生存曲线分析发现PYCR1高表达是肺癌复发及转移的危险因素,PYCR1高表达会导致患者总生存率下降。通过IHC检测肺腺癌病人的肿瘤标本组织及对应癌旁组织中PYCR1的表达量,验证了PYCR1在NSCLC组织中的表达明显高于癌旁组织这一结论。2.通过Western blot检测NSCLC细胞系中PYCR1的表达情况,我们发现PYCR1在五种常见NSCLC细胞系中均有表达。设计sh RNA进行慢病毒包装并感染95C细胞和H1299细胞,然后利用RT-q PCR及Western blot检测确认95C和H1299中PYCR1的表达被降低。3.在细胞表型实验中,敲减95C、H1299细胞中PYCR1后,MTT实验表明细胞的生长受到明显的抑制;克隆形成实验中细胞克隆形成的面积与克隆数量明显减少;细胞划痕实验显示细胞的迁移速度明显变慢。Annexin V/DAPI双染色法结合流式细胞术检测发现敲减95C细胞中PYCR1后细胞的早期凋亡与晚期凋亡较对照组上升。对细胞进行PI染色后检测发现PYCR1敲减组的G0/G1期下调、G2/M期上调。***实验结果表明在95C、H1299细胞中敲减PYCR1后,敲减组细胞的迁移能力及侵袭能力较对照组明显减弱。Western Blot实验表明,在95C、H1299细胞中敲减PYCR1后,钙粘附蛋白（E-cadherin）表达上升,蜗牛蛋白（Snail 1）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）表达水平出现不同程度的下降。研究结论以上结果显示PYCR1在NSCLC中发挥重要的功能,其在肺腺癌组织中的高表达意味着PYCR1可能是NSCLC形成的致癌基因。PYCR1在癌和癌旁的差异表达也表明PYCR1是肺癌预后生存率过低的危险因素。细胞实验表明,敲减PYCR1后,NSCLC的恶性生物学功能均受到不同程度的抑制,包括细胞增殖能力的减弱、迁移及侵袭能力的降低、克隆形成能力的减弱、细胞凋亡水平的上升以及诱导细胞阻滞在G2/M期。而且PYCR1的缺失会导致EMT形成过程的阻滞从而导致细胞侵袭和转移能力受到抑制。围绕PYCR1及相关信号通路开展深入研究,不仅有望发现用于早期诊断NSCLC的分子标记物,而且可能提出基于PYCR1及其信号通路的治疗新策略,具有重要的理论意义和应用价值。

关键词：吡咯啉-5-羧酸还原酶1 非小细胞肺癌凋亡迁移与侵袭上皮-间质转化

吡咯啉-5-羧酸还原酶1在非小细胞肺癌诊断和预后中的价值

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吡咯啉-5-羧酸还原酶1在非小细胞肺癌诊断和预后中的价值

作者：时楚炜安徽医科大学

学位级别：硕士

目的癌细胞的增殖转移等进程被发现与癌细胞蛋白质代谢调节相关,该领域已经成为癌症研究中的热门领域之一,寻找关键有效的肿瘤靶基因是现在肺癌的热点和难点。吡咯啉-5-羧酸还原酶1（pyrroline-5-carboxylate reductase 1,PYCR1）通过催... 详细信息

目的癌细胞的增殖转移等进程被发现与癌细胞蛋白质代谢调节相关,该领域已经成为癌症研究中的热门领域之一,寻找关键有效的肿瘤靶基因是现在肺癌的热点和难点。吡咯啉-5-羧酸还原酶1（pyrroline-5-carboxylate reductase 1,PYCR1）通过催化1-吡咯林-5-羧酸（1-Prroliline-5-carboxylic acid,P5C）还原为脯氨酸,同时产生NAD+和NADP+来参与脯氨酸代谢,脯氨酸是一种独特的氨基酸,是蛋白质的关键基石,在细胞的应激保护和氧化还原平衡中起着重要作用。已被证实脯氨酸在多种癌症中合成增加,本研究通过检测PYCR1在非小细胞肺癌患者（non-small cell lung cancer,NSCLC）组织和血清表达水平,分析其与患者临床病理资料关系,探讨其在NSCLC中的诊断效能和判断患者预后的价值。方法1.组织学标本检查:收集2011年7月至2016年1月期间,在我院胸外科接受了手术治疗的61例NSCLC患者肺癌组织及癌旁组织,用于免疫组化且临床病理资料完整,随访至2021年1月。检测PYCR1在其肺癌组织及癌旁组织中的表达情况。为进一步探究PYCR1的表达情况与患者临床病理资料的联系,我们通过Kaplan-Meier生存曲线及Cox比例风险模型分析PYCR1的表达情况与NSCLC患者预后的相关性。2.血清学标本检测:收集2020年6月至2021年6月就诊于本院呼吸内科,并经纤维支气管镜、经皮肺穿刺活检、内科胸腔镜等病理学检查初次确诊NSCLC的患者70例为实验组。以健康人群50例做为对照。采用双抗体夹心法测定PYCR1表达情况。结合患者临床病理资料,探讨PYCR1血清表达水平与患者临床病理特征的关系,通过受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）阐明其对NSCLC的诊断效能。结果1.免疫组化结果显示PYCR1在肺癌组织表达增高,在癌旁组织中不表达;结合患者临床病理资料,PYCR1高表达32例（52.46%）,低表达29例（47.54%）,其表达情况与淋巴结转移（P=0.021）、临床分期（P=0.005）相关,与肿瘤大小（P=0.087）、病理类型（P=0.394）、分化程度（P=0.786）无关。Kaplan-Meier生存曲线显示PYCR1表达增高提示患者预后不良。PYCR1高表达的患者生存时间明显低于低表达患者。Ⅲ期肺癌患者的生存时间明显低于Ⅰ期和Ⅱ期。不同病理类型生存曲线未见差异。单因素分析显示患者生存与临床分期（P＜0.001）、PYCR1高表达（P=0.032）和淋巴结转移（P=0.028）相关。多因素分析结果示PYCR1的高表达是NSCLC患者预后不良的独立危险因素（HR:2.367,95%CI:1.164-5.235,P=0.002）。2.实验组70例NSCLC患者血清中PYCR1蛋白的表达水平为（1057.62±114.39）ng/m L,而对照组50例健康人血清中PYCR1蛋白的表达水平为（287.83±43.25）ng/m L（P＜0.001）。在I和II期组患者血清PYCR1蛋白的表达水平为（865.41±110.09）ng/m L,显著低于III和IV期组的（1275.68±119.42）ng/m L（P＜0.05）。无淋巴结转移者PYCR1蛋白的表达水平为（836.27±98.78）ng/m L,存在淋巴结转移组为（1235.34±112.06）ng/m L,有淋巴结转移组PYCR1的表达水平明显高于无淋巴结转移组（P＜0.05）。建立ROC曲线结果显示,选择PYCR1为627.24ng/m L,诊断NSCLC的特异度为76.92%,灵敏度89.66%。联合癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）、细胞角蛋白19片段（cytokeratin-19-feagment,CYFRA21-1）进行三指标检测,特异度为84.62%,灵敏度90.43%。结论***1在NSCLC组织中表达增高,与预后密切相关,是影响预后的独立危险因素。***1在NSCLC患者外周血表达水平增加,与CEA和CYFRA21-1的三指标联合检测表现出更好的诊断效能。

关键词：吡咯啉-5-羧酸还原酶1 非小细胞肺癌诊断预后

阿魏酸结合吡咯啉-5-羧酸还原酶1抑制乳腺癌细胞增殖

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中国生物化学与分子生物学报 2023年第1期39卷 79-86页

作者：杨睿鹏安宁单树花史江颖李汉卿贺水玲李卓玉山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室太原030006

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一,严重威胁女性健康。天然产物因其结构多样、毒副作用低及作用机制独特等优势已然成为开发抗肿瘤药物的主要来源。以人乳腺癌细胞MCF-7和小鼠乳腺癌细胞4T1为研究对象,探索植物源多酚类物质阿魏酸(ferulic ... 详细信息

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一,严重威胁女性健康。天然产物因其结构多样、毒副作用低及作用机制独特等优势已然成为开发抗肿瘤药物的主要来源。以人乳腺癌细胞MCF-7和小鼠乳腺癌细胞4T1为研究对象,探索植物源多酚类物质阿魏酸(ferulic acid,FA)对乳腺癌细胞的影响。细胞存活实验和克隆形成实验表明,阿魏酸可以抑制MCF-7和4T1细胞的存活和增殖,且抑制效应具有浓度依赖性。通过Pull-down、银染和LC-MS-MS质谱鉴定分析发现,FA与蛋白质吡咯啉-5-羧酸还原酶1(pyrroline-5-carboxylate reductase 1,PYCR1)有直接相互作用。PYCR1体内能通过酶促反应催化脯氨酸代谢合成,发挥促进肿瘤生长和增殖的作用。使用Autodock Vina和PyMOL软件模拟分子对接,结果显示,FA与PYCR1的246位谷氨酸和251位精氨酸存在相互作用;通过酶活力检测证实,FA靶向结合PYCR1且以浓度依赖性的方式抑制其酶活性;通过分析人类肿瘤基因图谱(TCGA)发现,PYCR1在乳腺癌患者中的表达显著高于健康对照人群(P<0.0001),且高表达的PYCR1与临床不良预后高度相关。

关键词：乳腺癌阿魏酸吡咯啉-5-羧酸还原酶1 分子对接

吡咯啉-5-羧酸还原酶-1、增殖细胞核抗原和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3在膀胱尿路上皮癌中的表达及检测临床意义

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陕西医学杂志 2023年第8期52卷 1097-1101页

作者：柏慧王卓关有良李良锦州医科大学附属第一医院辽宁锦州121000 锦州医科大学附属第三医院辽宁锦州121000

目的:观察膀胱尿路上皮癌中吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)、增殖细胞核抗原(PCNA)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)的表达特征。方法:选择确诊为膀胱尿路上皮癌的患者63例作为观察组,选择经病理证实为正常膀胱黏膜的组织63... 详细信息

目的:观察膀胱尿路上皮癌中吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)、增殖细胞核抗原(PCNA)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)的表达特征。方法:选择确诊为膀胱尿路上皮癌的患者63例作为观察组,选择经病理证实为正常膀胱黏膜的组织63例作为对照组,应用免疫组化法检测组织中PYCR1、PCNA和Caspase-3的表达,分析PYCR1、PCNA和Caspase-3在观察组不同临床病理特征中的表达差异及与术后生存时间的相关性。结果:PYCR1和PCNA在观察组中的阳性率均明显高于对照组,Caspase-3在观察组中的阳性率明显低于对照组(均P5);观察组中PYCR1、PCNA和Caspase-3的表达与病变分级、浸润深度、脉管癌栓和是否伴鳞状分化密切相关(均P5),而与性别、年龄、神经累犯无明显相关性(均P>0.05);PYCR1、PCNA和Caspase-3的表达均与术后生存时间有关;观察组中PYCR1与PCNA具有正相关性,PYCR1与Caspase-3具有负相关性,而PCNA与Caspase-3无明显相关性。结论:膀胱尿路上皮癌中PYCR1和PCNA高表达、Caspase-3低表达均参与病变的形成和进展,联合检测PYCR1、PCNA和Caspase-3的表达对判断预后有一定价值。PYCR1与增殖指标PCNA、凋亡指标Caspase-3均有一定关联性。

关键词：膀胱尿路上皮癌吡咯啉-5-羧酸还原酶1 细胞增殖细胞凋亡预后临床特征

lncRNA MIF-AS1调节miR-423-5p/PYCR1轴对前列腺癌细胞恶性生物学行为的影响

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实用医学杂志 2024年第18期40卷 2544-2549页

作者：杨剑波邵继春曾治军赵涛王兴成都医学院第二附属医院/核工业四一六医院泌尿外科成都610057

目的探究长链非编码RNA(lncRNA)巨噬细胞移动抑制因子反义RNA1(MIF-AS1)调节miR-423-5p/吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)轴对前列腺癌(PC)细胞恶性生物学行为的影响。方法体外培养PC3细胞,敲低MIF-AS1或下调miR-423-5p表达,检测PC患者肿瘤... 详细信息

目的探究长链非编码RNA(lncRNA)巨噬细胞移动抑制因子反义RNA1(MIF-AS1)调节miR-423-5p/吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)轴对前列腺癌(PC)细胞恶性生物学行为的影响。方法体外培养PC3细胞,敲低MIF-AS1或下调miR-423-5p表达,检测PC患者肿瘤组织与癌旁组织和细胞中MIF-AS1、miR-423-5p和PYCR1 mRNA的表达;检测细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭;Western blot检测PYCR1蛋白表达;验证miR-423-5p和MIF-AS1、PYCR1的关系。结果MIF-AS1、PYCR1 mRNA在肿瘤组织中呈高表达,miR-423-5p呈低表达。沉默MIF-AS1可抑制PC3细胞增殖、迁移、侵袭及PYCR1表达,上调miR-423-5p表达,诱导细胞凋亡(P5);抑制miR-423-5p表达可逆转沉默MIF-AS1对PC3细胞恶性行为的抑制作用(P5)。MIF-AS1、PYCR1与miR-423-5p存在靶向调控关系。结论沉默MIF-AS1可能通过上调miR-423-5p来抑制PYCR1表达,抑制PC细胞的恶性行为。

关键词：长链非编码RNA巨噬细胞移动抑制因子反义RNA1 miR-423-5p 吡咯啉-5-羧酸还原酶1 前列腺癌恶性生物学行为

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PYCR1对胃癌细胞增殖和侵袭的影响

现代肿瘤医学 2021年第12期29卷 2030-2035页

作者：孙娟林晖王耀新蔡惠美唐晶晶福州市第一医院消化内科福建福州350001

目的:探讨人吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)对胃癌细胞AGS增殖和侵袭的影响。方法:人胃癌细胞AGS转染敲减和过表达PYCR1的质粒,设置3种敲减序列,qRT-PCR和Western Blot检测PYCR1 mRNA和蛋白表达以验证敲减效率,并以敲减效率最好的进行后... 详细信息

目的:探讨人吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)对胃癌细胞AGS增殖和侵袭的影响。方法:人胃癌细胞AGS转染敲减和过表达PYCR1的质粒,设置3种敲减序列,qRT-PCR和Western Blot检测PYCR1 mRNA和蛋白表达以验证敲减效率,并以敲减效率最好的进行后续实验,AGS细胞分为si-NC组、si-PYCR1组、pcDNA组、PYCR1组,采用CCK8检测各组不同时间点细胞活力,采用伤口愈合实验检测各组迁移能力,采用Transwell实验检测各组迁移和侵袭能力。结果:qRT-PCR和Western Blot检测结果发现,三种敲减序列PYCR1 mRNA和PYCR1蛋白均低于si-NC组,过表达PYCR1组PYCR1 mRNA和PYCR1蛋白高于pcDNA组,差异均有统计学意义(P5)。CCK8检测各组细胞增殖活力,结果发现,si-PYCR1组48 h、72 h和96 h细胞活力显著低于si-NC组相同时间点,而PYCR1组48 h、72 h和96 h细胞活力高于pcDNA组,差异均有统计学意义(P5)。伤口愈合实验检测各组细胞迁移能力,以48 h/0 h划痕宽度进行定量分析,结果发现,si-PYCR1组48 h/0 h划痕宽度高于si-NC组,PYCR1组48 h/0 h划痕宽度低于pcDNA组,差异均有统计学意义(P5)。Transwell实验检测各组细胞迁移和侵袭能力,以迁移和侵袭细胞数进行定量分析,结果发现,si-PYCR1组迁移和侵袭细胞数少于si-NC组,PYCR1组迁移和侵袭细胞数多于pc DNA组,差异均有统计学意义(P 5)。结论:PYCR1可以促进胃癌细胞增殖、迁移及侵袭,可能是胃癌发病机制的关键分子和治疗的新靶点。

关键词：吡咯啉-5-羧酸还原酶1 胃癌增殖侵袭