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吗啡预处理对H9c2心肌细胞缺氧/复氧时microRNA表达的影响

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中国药理学通报 2015年第11期31卷 1552-1557页

作者：韩正怡何淑芳程洁许士进杨婉张野安徽医科大学第二附属医院麻醉科安徽合肥230601

目的探讨吗啡预处理(morphine preconditioning,MPC)对H9c2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia reoxygenation,H/R)时microRNA(miRNA)表达的影响,为明确其机制提供参考。方法培养H9c2心肌细胞,随机分为3组(n=4):1正常对照组(CON):H9c2心肌细胞置于DMEM/F12细胞培养液常规培养;2缺氧/复氧组(H/R):对心肌细胞行缺氧5h/复氧1h处理;3吗啡预处理组(MPC+H/R):在H/R前,应用1μmol·L^(-1)吗啡预处理10 min。处理结束后,采用CCK-8法检测细胞增殖、化学比色法检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、Annexin-V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡、Western blot法检测细胞内Fas蛋白表达、荧光定量RT-PCR法检测细胞miRNA表达水平。结果与CON组比,H/R组细胞活力降低,LDH活性升高,细胞凋亡率增加,Fas蛋白水平升高(P吗啡预处理减轻H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤可能与调控miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216和let7e-5p等miRNA表达有关。

关键词：吗啡预处理 H9c2心肌细胞缺氧/复氧凋亡 Fas 微小RNA

吗啡预处理对兔缺氧/复氧损伤肝脏组织的保护作用

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四川大学学报（医学版） 2010年第3期41卷 412-414页

作者：江晓琴倪娟杨沛黄蔚罗金凤李华凤四川大学华西第二医院麻醉科成都610041 四川大学华西第二医院妇产科成都610041

目的探讨吗啡预处理对兔缺氧/复氧损伤肝脏组织的保护作用及其机制。方法雄性新西兰大白兔30只随机分成正常对照组(N组)、缺氧复氧组(H/R组)和吗啡预处理组(MO+H/R组)。H/R组和MO+H/R组分别静脉注射生理盐水5 mL和吗啡3 mg/kg后,吸入8%O... 详细信息

目的探讨吗啡预处理对兔缺氧/复氧损伤肝脏组织的保护作用及其机制。方法雄性新西兰大白兔30只随机分成正常对照组(N组)、缺氧复氧组(H/R组)和吗啡预处理组(MO+H/R组)。H/R组和MO+H/R组分别静脉注射生理盐水5 mL和吗啡3 mg/kg后,吸入8%O23 h,空气复氧3 h。比较各组肝脏组织凋亡指数(AI)、超氧化物歧化酶(SOD)水平和肝脏组织病理学改变。结果与N组比,H/R组肝脏组织AI增加〔(0.43±0.13)%vs.(9.50±1.00)%,P吗啡预处理可增强肝脏组织中SOD的表达(P吗啡预处理可增强肝脏组织SOD的活力,减轻氧自由基引起的细胞凋亡,进而对缺氧/复氧损伤肝脏发挥保护作用。

关键词：吗啡预处理缺氧/复氧损伤细胞凋亡

吗啡预处理对兔缺氧/复氧损伤肾脏组织SOD和MDA的影响

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四川大学学报（医学版） 2010年第5期41卷 885-887页

作者：江晓琴倪娟杨沛黄蔚罗金凤李华凤四川大学华西第二医院麻醉科成都610041 四川大学华西第二医院妇产科成都610041

目的探讨吗啡预处理对兔缺氧复氧损伤肾脏组织的超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的影响。方法雄性新西兰大白兔27只随机分成正常对照组(N组)、缺氧复氧组(H/R组)和吗啡预处理组(MO+H/R组)。H/R组和MO+H/R组分别静脉注射生理盐水5 mL... 详细信息

目的探讨吗啡预处理对兔缺氧复氧损伤肾脏组织的超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的影响。方法雄性新西兰大白兔27只随机分成正常对照组(N组)、缺氧复氧组(H/R组)和吗啡预处理组(MO+H/R组)。H/R组和MO+H/R组分别静脉注射生理盐水5 mL和吗啡3 mg/kg后吸入8%O23 h后空气复氧3h。比较各组肾脏组织SOD、MDA水平和肾脏含水量。结果与N组比,H/R组明显降低SOD活力〔(226±13.3)U/g,P吗啡缺氧预处理明显增加了肾脏组织SOD活力〔(294±14.1)nmol/L,P吗啡缺氧预处理可能减轻缺氧复氧损伤肾脏中MDA的生成,增强SOD的活力,从而发挥对兔缺氧复氧损伤肾脏的保护作用。

关键词：吗啡预处理缺氧复氧损伤氧化应激丙二醛超氧化物歧化酶

吗啡预处理减轻脑中动脉阻塞所致小鼠缺血性脑损伤

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基础医学与临床 2012年第7期32卷 809-813页

作者：刘雅韩松李俊发张炳熙河北医科大学第二医院麻醉科河北石家庄050000 首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京100069 首都医科大学北京同仁医院麻醉科北京100730

目的探讨吗啡预处理(MP)对小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)所致缺血性脑损伤的影响及其可能机制。方法复制小鼠MCAO模型,用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色、神经行为学评分和Western blot等,观察小鼠行为学变化、脑梗死面积、脑水肿率,以及s... 详细信息

目的探讨吗啡预处理(MP)对小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)所致缺血性脑损伤的影响及其可能机制。方法复制小鼠MCAO模型,用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色、神经行为学评分和Western blot等,观察小鼠行为学变化、脑梗死面积、脑水肿率,以及sham组左侧皮质组织,MCAO组和MP组脑梗死核心区、半影区及对侧皮质组织热休克蛋白70(Hsp70)蛋白表达量。结果 MCAO组小鼠脑梗死面积为31.69%±4.19%,脑水肿率为8.98%±1.79%,MP可明显降低MCAO所致的脑梗死面积及水肿率,分别为23.34%±4.85%和4.60%±0.86%(P吗啡预处理降低小鼠脑中动脉阻塞所致缺血性脑损伤,半影区Hsp70蛋白水平的高表达可能参与了这种保护作用。

关键词：吗啡预处理脑中动脉阻塞缺血半影区热休克蛋白70

ERK信号蛋白在吗啡预处理减轻大鼠全心缺血/再灌注损伤中的作用

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中国药理学通报 2018年第2期34卷 232-236页

作者：黄俊杨婉金世云产进中刘中张野何淑芳安徽医科大学第二附属医院麻醉科安徽合肥230601

目的探讨细胞外信号调节激酶(extracellular signaling-regulated kinase,ERK)在吗啡预处理减轻大鼠全心缺血/再灌注损伤中的作用。方法健康成年♂SD大鼠,采用随机数字表法分为6组(n=10):对照组(control,CON)、缺血/再灌注组(ischemia/r... 详细信息

目的探讨细胞外信号调节激酶(extracellular signaling-regulated kinase,ERK)在吗啡预处理减轻大鼠全心缺血/再灌注损伤中的作用。方法健康成年♂SD大鼠,采用随机数字表法分为6组(n=10):对照组(control,CON)、缺血/再灌注组(ischemia/reperfusion,I/R)、缺血预处理组(ischemia preconditioning,IPC)、吗啡1μmol·L^(-1)预处理组(morphine preconditioning,MPC)、MPC+ERK抑制剂PD98059组(MPD)、ERK抑制剂PD98059对照组(PD)。利用Langendorff灌流系统对各组大鼠离体心脏在进行相应处理后,化学比色法检测基线、再灌注5、10 min时冠脉流出液乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性;同时利用充水球囊置入左心室持续监测左心室发展压(left ventricular developed pressure,LVDP)。2,3,5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色测量梗死区(infarct size,IS)、缺血危险区(area at risk,AAR)体积及IS/AAR比值;Western blot检测心肌组织ERK磷酸化水平。结果与I/R组比较,MPC组IS和IS/AAR减小,再灌注5、10 min时LDH活性降低,再灌注结束时LVDP升高,心肌组织磷酸化ERK(p-ERK)相对表达量增加;ERK抑制剂PD98059阻断MPC的保护作用,增加心肌梗死面积,升高再灌注5、10 min时LDH活性,降低再灌注末LVDP,此外,PD98059抑制MPC诱导的ERK磷酸化。结论吗啡预处理可能通过诱导ERK磷酸化水平升高而减轻大鼠全心缺血/再灌注损伤。

关键词：细胞外信号调节激酶吗啡预处理阿片受体全心缺血/再灌注损伤心肌保护

吗啡预处理经由ERK通路调控受体相互作用蛋白减轻大鼠全心缺血再灌注损伤的作用机制

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吗啡预处理经由ERK通路调控受体相互作用蛋白减轻大鼠全心缺血再...

作者：黄俊安徽医科大学

学位级别：硕士

背景全心缺血再灌注损伤常见于体外循环下的心脏及大血管手术、心跳骤停后心肺复苏等,缺血的心肌在循环开放或冠脉血流恢复后,可能会加重心肌损伤,给麻醉和患者生命安全造成严重威胁。已有大量研究表明吗啡预处理(morphine precondition... 详细信息

背景全心缺血再灌注损伤常见于体外循环下的心脏及大血管手术、心跳骤停后心肺复苏等,缺血的心肌在循环开放或冠脉血流恢复后,可能会加重心肌损伤,给麻醉和患者生命安全造成严重威胁。已有大量研究表明吗啡预处理(morphine preconditioning,MPC)可显著减轻局部心肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI),而MPC是否可减轻全心缺血再灌注导致的心肌损伤,其机制如何,目前尚不明确。心肌细胞死亡是很多心脏疾病的共同特征,主要包括坏死、凋亡以及细胞自噬。事实上,在心肌缺血再灌注过程中,由于坏死而损失的心肌细胞可能远大于凋亡所致的细胞死亡。冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)活性升高也是心肌坏死的重要标志。程序性坏死(necroptosis)是一种全新的细胞死亡方式,这种细胞坏死虽然在形态学上与传统意义上的坏死相似,但与细胞凋亡一样受到体内细胞信号通路的严格调控。最近研究发现,程序性坏死在心肌IRI中发挥重要作用,而且受体相互作用蛋白(receptor interacting protein,RIP)是心肌细胞程序性坏死信号中的关键效应分子。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)是重要的促生存激酶,再灌注早期激活ERK信号通路可有效促进心肌细胞存活,缩小心肌梗死面积。我们前期研究表明MPC通过激活ERK信号通路减轻心肌IRI,本课题拟在前期研究基础上,探讨ERK信号通路在MPC减轻大鼠全心IRI损伤中的作用,并进一步探究MPC是否通过活化ERK信号通路影响心肌程序性坏死信号通路中的关键分子RIP1和RIP3表达,以期初步阐明吗啡在全心缺血再灌注损伤中发挥心肌保护作用的分子机制。方法雄性SD大鼠,体重250-300 g,随机分为8组(n=10):对照组(CON组)、缺血再灌注组(I/R组)、缺血预处理组(IPC组)、不同浓度吗啡预处理组(MPC0.3,1,3mM三组)、MPC+ERK抑制剂PD98059组(MPD组)、抑制剂PD98059对照组(PD组)。采用Langendorff设备进行离体心脏全心灌注-停灌40 min、再灌注90 min方法制备大鼠全心缺血再灌注损伤(IRI)模型。除CON组心脏持续灌注K-H液外,其余各组心脏均经历全心灌注-停灌40 min、再灌注90 min。IPC组在缺血再灌注前,预先全心停灌5 min,再灌注K-H液5 min,共3个循环;MPC各浓度组在缺血前,预先分别灌注含0.3、1、3mM吗啡的K-H液5 min,再灌注无药K-H液5 min,共3个循环;MPD组于MPC前10 min持续灌注含有PD98059(10mM)的K-H液直至吗啡预处理结束;PD组在相同时间点灌注抑制剂但不进行吗啡预处理或缺血预处理。灌注期间使用注水乳胶球囊置入到大鼠心脏左心室,使用Power Lab生物机能系统测量心脏血流动力学参数包括心率(HR)和左室发展压(LVDP)。分别于各组心脏跳动稳定后收集并测量冠脉流出液,检测乳酸脱氢酶(LDH)活性,再灌注10 min时取下大鼠心脏提取心肌蛋白,使用Western Blot法检测心肌ERK磷酸化水平及RIP1/3蛋白表达(n=4);再灌注90 min时取下大鼠心脏,通过TTC染色法测量梗死区(IS)、缺血危险区(AAR)体积及IS/AAR比值(n=6)。结果1.成功建立大鼠全心IRI模型CON组于整个实验灌注过程中HR:294～369 bpm,LVDP:90～140 mm Hg;冠脉流出液:11～24 ml/min;而IR组,HR于缺血前:292～364 bpm,再灌注后:200-261 bpm;LVDP于缺血前:117～135 mm Hg,再灌注后:14～22 mm Hg;冠脉流出液于缺血前:13～25 ml/min,再灌注后:5～9 ml/min。两组差异有统计学意义(P<0.05),全心缺血时心脏搏动微弱,心肌组织苍白;TTC染色后显示IR组心肌梗死大小明显大于CON组(P<0.05)。2.不同浓度MPC对大鼠离体心脏全心IRI的作用在大鼠离体心脏中,0.3mmol/L和1mmol/L的MPC可以显著减轻大鼠离体心脏IRI,缩小心肌梗死面积和再灌注后冠脉流出液中LDH活性,促进再灌注时心功能LVDP的恢复,而浓度大于3mmol/L的MPC反而不能有效减轻心脏的IRI。***对ERK蛋白磷酸化以及RIP表达的影响MPC(0.3,1mM)促进心肌组织ERK磷酸化,而抑制RIP1和RIP3的表达水平,MPC(3mM)对心肌组织ERK磷酸化以及RIP1和RIP3的水平无显著影响。2.3 PD98059对MPC介导大鼠全心缺血再灌注损伤保护作用的影响在大鼠离体心脏中

关键词：缺血再灌注损伤吗啡预处理心肌保护细胞外调节激酶受体相互作用蛋白

吗啡预处理对阿霉素所致的慢性充血性心力衰竭大鼠心肌细胞缺氧再给氧损伤的保护作用

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吗啡预处理对阿霉素所致的慢性充血性心力衰竭大鼠心肌细胞缺氧再...

作者：黄春霞安徽医科大学

学位级别：硕士

目的心力衰竭作为临床常见的危重症，是多种心血管疾病的末期表现，严重威胁患者的健康。阿霉素因其很好的抗肿瘤疗效而在临床上广泛使用，但其严重的心肌损害引起越来越多的重视。外科手术中心脏的缺血再灌注损伤亦是很常见，而经典的... 详细信息

目的心力衰竭作为临床常见的危重症，是多种心血管疾病的末期表现，严重威胁患者的健康。阿霉素因其很好的抗肿瘤疗效而在临床上广泛使用，但其严重的心肌损害引起越来越多的重视。外科手术中心脏的缺血再灌注损伤亦是很常见，而经典的缺血预处理早已被证明显现出很好的保护作用。本研究将观察吗啡预处理阿霉素致慢性充血性心力衰竭大鼠心肌细胞缺氧再给氧损伤的作用，并探讨可能的作用机制。方法成年♂SD大鼠，体重220-250g，尾静脉注射阿霉素2mg/kg，每周一次，计六周，累积剂量达12mg/kg，观察大鼠一般情况。末次注射2周后，麻醉大鼠后用0.05%I型胶原酶分离原代心肌细胞，正常培养48h后，随机将心肌细胞分组：正常对照组（CON），缺氧预处理组（HPC），不同剂量吗啡（0.03,0.1,0.3,1,3μmol/L）预处理组（MPC），除CON外均给予缺氧-再给氧处理。分别检测缺氧前后和再给氧前后及预处理后培养液中LDH水平和CK的活性，采用MTT检测各组相应处理后的心肌细胞活力。为进一步研究其机制，又将心肌细胞细分组：正常对照组（CON），缺氧预处理组（HPC），吗啡（1μmol/L）预处理组（MPC），纳洛酮组（Nal），钠曲吲哚组（Nat），缺氧预处理+纳洛酮组（HPC+Nal），吗啡预处理+纳洛酮组（MPC+Nal），缺氧预处理+钠曲吲哚组（HPC+Nat），吗啡预处理+钠曲吲哚组（MPC+Nat）。两种阻断剂分别在预处理前10min分别加入非选择性阿片受体阻断剂纳洛酮（10μmol/L）和δ-阿片受体阻断剂钠曲吲哚（1μmol/L），分别检测缺氧前后和再给氧前后培养液中LDH水平和CK的活性，采用胎盘蓝染色和MTT检测处理后的各组心肌细胞活力，Hoechst33234染色检测凋亡率。结果与CON组相比，H/R组心肌细胞活力明显降低，凋亡细胞数增加，而LDH和CK活性明显升高（P预处理对对阿霉素所致的慢性充血性心力衰竭大鼠心肌细胞缺氧再给氧损伤无保护作用，吗啡预处理有保护作用，且该作用可能是通过激活阿片受体介导的，主要为δ-阿片受体。

关键词：心力衰竭吗啡预处理缺氧再给氧心肌保护

吗啡预处理诱导的血清外泌体对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用与机制

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吗啡预处理诱导的血清外泌体对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用...

作者：刘中安徽医科大学

学位级别：硕士

背景与目的心肌在缺血基础上血流再灌注后损伤进一步加重,称为心肌缺血再灌注(ischemic reperfusion,I/R)损伤,常发生于心脏手术中,不但降低再灌注治疗的临床疗效,而且可能进一步加重心肌损伤和增加心力衰竭发生率,严重影响患者的心脏... 详细信息

背景与目的心肌在缺血基础上血流再灌注后损伤进一步加重,称为心肌缺血再灌注(ischemic reperfusion,I/R)损伤,常发生于心脏手术中,不但降低再灌注治疗的临床疗效,而且可能进一步加重心肌损伤和增加心力衰竭发生率,严重影响患者的心脏功能。而心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤是在体外研究心肌I/R损伤的理想模型,可以直接观察损伤的心肌细胞形态、代谢、功能等变化,普遍应用于I/R损伤的分子机制研究。外泌体(exosome)是新近发现的一种囊泡样小体,具有双层膜结构,其中包含丰富的蛋白质、脂类、微小RNA(micro RNA,mi RNA)等,可传输多种信号分子,是实现细胞间物质交换及信息传递的重要媒介。mi RNA是新发现的一类内源性小分子非编码RNA,可通过其下游的靶基因和信号通路,调控心肌细胞的凋亡过程,在心肌I/R损伤中发挥重要作用。本课题组前期研究结果表明mi R-133b-5p参与了吗啡预处理(morphine preconditioning,MPC)的心肌保护作用。鉴于前期的研究基础,本课题拟进一步探讨MPC诱导释放的血清外泌体对大鼠心肌细胞H/R损伤的作用和潜在的机制以及外泌体是否参与了MPC的心肌保护作用,为研究阿片类药物的心肌保护机制提供新的思路和理论依据。方法1.外泌体的提取与鉴定大鼠进行MPC或对照处理(CON)后,收集大鼠血清,采用Exo Quick?试剂盒提取血清中的外泌体,分别标记为MPC-Exo、CON-Exo。利用透射电镜和Western Blot进行外泌体鉴定,BCA法测定外泌体浓度。2.外泌体的标记与摄取将外泌体用Di I染料标记后加入细胞培养基中,与H9c2心肌细胞共培养12h,随后PBS洗涤和4%多聚甲醛固定,最后用荧光显微镜观察心肌细胞对外泌体的摄取情况。3.外泌体在MPC减轻心肌细胞H/R损伤中的作用H9c2心肌细胞随机分为对照组(Control)、缺氧复氧组(H/R)、MPC组(吗啡预处理组)、MPC+GW4869组(抑制剂组)、H/R+DMSO组(溶剂对照组)、H/R+GW4869组(抑制剂对照组)。Control组细胞置于DMEM/F12细胞培养液中常规培养;H/R组细胞给予5 h缺氧和1 h复氧处理;MPC组细胞于H/R损伤前用含1μmol/L吗啡的培养液孵育10 min,然后用不含吗啡的培养液正常培养30min;MPC+GW4869组细胞于H/R损伤前用5μmol/L外泌体释放抑制剂GW4869处理12 h,随后进行MPC;H/R+DMSO组细胞于H/R损伤前用5μmol/L DMSO处理12 h;H/R+GW4869组于H/R损伤前用5μmol/L GW4869处理12 h。各组处理结束后,采用CCK-8法检测细胞活力;微量酶标法测定培养液中乳酸脱氢酶(lactic acid dehydrogenase,LDH)的活性;流式细胞术检测细胞凋亡。***-Exo对H9c2心肌细胞H/R损伤的作用H9c2心肌细胞随机分为对照组(Control)、缺氧复氧组(H/R)、H/R+CON-Exo组、H/R+MPC-Exo组。Control组细胞置于DMEM/F12细胞培养液中常规培养;H/R组细胞给予5 h缺氧和1 h复氧处理;H/R+CON-Exo组和H/R+MPC-Exo组心肌细胞在H/R损伤前分别与CON-Exo或MPC-Exo共孵育12 h。各组处理结束后,采用CCK-8法检测心肌细胞活力;微量酶标法测定培养液中LDH的活性;流式细胞术检测细胞凋亡;q RT-PCR检测心肌细胞内以及外泌体内mi R-133b-5p的表达。结果1.外泌体的提取与鉴定大鼠血清的外泌体提取物在电镜下观察,呈圆形囊泡,平均直径约30-150 nm;Western blot结果显示其表达特异性标志蛋白CD63、热休克蛋白-60(heat shock proterin-60,HSP60)。2.外泌体的标记与摄取荧光显微镜下可见大量红色颗粒样物质在胞质中聚集,提示外泌体能被H9c2心肌细胞摄取。3.外泌体在MPC减轻心肌细胞H/R损伤中的作用与H/R组比较,MPC能显著减轻心肌细胞H/R损伤,增强细胞活力、减少LDH释放、抑制心肌细胞凋亡(P<0.05);与MPC组比较,MPC+GW4869组心肌细胞活力降低,LDH释放增加,细胞凋亡增多(P<0.05),MPC的保护作用被GW4869阻断。***-Exo对H9c2心肌细胞H/R损伤的作用MPC-Exo与H9c2心肌细胞共孵育,可以显著减轻心肌细胞H/R损伤,增强心肌细胞活力、减少LDH释放、并抑制心肌细胞凋亡,且显著上调心肌细胞内mi R-133b-5p的水平(P<0.05);相反,CON-Ex

关键词：吗啡预处理外泌体缺氧复氧损伤心肌细胞 miR-133b-5p

吗啡预处理保护心力衰竭大鼠心肌细胞缺氧再给氧损伤的相关特异性microRNA的筛选验证及生物信息学分析

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吗啡预处理保护心力衰竭大鼠心肌细胞缺氧再给氧损伤的相关特异性...

作者：朱海娟安徽医科大学

学位级别：硕士

背景心力衰竭是各种心脏疾病发展的严重阶段，及时手术治疗是冠心病、心脏瓣膜病等所致心力衰竭患者延长生命、改善预后的关键，但这类患者更易发生围术期心肌缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, IRI），给麻醉安全和患者生... 详细信息

背景心力衰竭是各种心脏疾病发展的严重阶段，及时手术治疗是冠心病、心脏瓣膜病等所致心力衰竭患者延长生命、改善预后的关键，但这类患者更易发生围术期心肌缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, IRI），给麻醉安全和患者生命都带来严重威胁。本课题组发现经典的心肌保护措施缺氧预处理（Hypoxicpreconditioning, HPC）对心力衰竭心肌细胞缺氧再给氧损伤（Hypoxia-reoxygenationinjury, HR injury）的保护作用消失而吗啡预处理（Morphine preconditioning, MPC）的保护作用仍存在，其机制尚待阐明。MicroRNA(miRNA)是近年来新发现的一类小分子非编码RNA，参与调控心肌缺血再灌注损伤、缺血预处理的保护作用、心衰发展、阿片药理作用等多个过程，但miRNA是否介导MPC保护心衰心肌细胞缺氧再给氧损伤目前尚未见报道。本研究利用微阵列分析技术探索MPC对心力衰竭大鼠心肌细胞microRNA (miRNA)表达谱的影响并预测分析miRNA的靶基因及其功能。方法选择健康成年雄性SD大鼠，尾静脉注射阿霉素制备慢性心力衰竭模型，分离心室肌细胞，制备心肌细胞MPC及HR损伤模型，本课题实验分为两部分完成。实验一，miRNA芯片筛选。心室肌细胞随机分为3组：正常对照组（nCON）、心衰对照组（fCON）、心衰吗啡预处理组（fMPC）。各组处理后即刻收集细胞，提取总RNA行芯片分析检测miRNA表达谱的变化，重点比较fCON和fMPC组间差异表达的miRNA;TargetScan、miRanda软件预测差异表达miRNA的靶基因，GO（基因功能）和KEGG Pathway（信号通路）分析靶基因功能，构建miRNA-基因网络调控图，识别可能的核心miRNA及靶基因。实时定量PCR（quantitiverealtime PCR, qRT-PCR）法验证芯片结果。实验二，根据生物信息学分析结果，选择miR-133b-5p为目的miRNA，进一步检测其靶基因Fas在心衰心肌细胞HR损伤中的表达变化及预处理的干预作用。正常和心衰心肌细胞分离后，分为4组：正常对照组（nCON）、心衰对照组（fCON）、心衰缺氧再给氧组（fHR）、心衰吗啡预处理组（fMPC+HR）。各组处理完毕后收集细胞提取RNA及蛋白，行qRT-PCR和Western blot检测靶基因Fas mRNA和蛋白表达水平。结果1. miRNA芯片分析结果miRNA芯片分析显示，与nCON组比较，fCON组有5个miRNA上调7个miRNA下调;与fCON组比较，fMPC组有8个miRNA上调10个miRNA下调（p500）。其中miR-133b-5p、miR-6216、miR-664-1-5p、let7e-5p等miRNA发生了显著改变（Fold change>2）。miR-133b-5p在心衰心肌细胞（fCON vs. nCON）中显著下调，而经MPC处理后miR-133b-5p表达水平增加（fMPC vs. fCON）;miR-6216，let7e-5p在心衰心肌细胞中均显著上调，但经MPC处理后表达水平降低。miR-664-1-5p在心衰过程中差异无显著性，而fMPC处理后其表达显著下调。2.靶基因生物信息学分析GO及KEGG Pathway分析发现fMPC诱导差异表达的miRNA所调控的靶基因主要与凋亡、钙稳态、MAPK信号通路等功能有关。miRNA-gene-network发现miR-133b-5p及Fas可能是介导凋亡的核心miRNA和靶基因，并发现Fas的3’UTR区域含有miR-133b-5p的特异性结合位点。3. qRT-PCR验证芯片结果qRT-PCR结果显示在nCON、fCON、fMPC三组中miR-133b-5p、miR-6216及let7e-5p的表达水平和变化趋势与miRNA芯片分析结果一致。4. miR-133b-5p的靶基因Fas在心衰心肌细胞HR损伤中的表达及MPC的干预作用qRT-PCR结果显示，与nCON组比较，fCON组Fas mRNA表达增加，与fCON比较，fHR组Fas mRNA表达下调，而fMPC+HR组较之fHR组则进一步下调（p<0.01）;Western blot结果显示，与nCON组比较，fCON组Fas蛋白表达亦显著增加，不同于mRNA表达，fHR组与fCON组比较Fas蛋白表达进一步增加，而fMPC+HR组较之fHR组则降低（p<0.01）。从各组Fas蛋白表达的变化趋势，我们发现miR-133b-5p和Fas蛋白存在一种反向调节的关系。结论M

关键词：心力衰竭吗啡预处理缺氧再给氧损伤 microRNA芯片生物信息学分析