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Baeyer-Villiger单加氧酶非保守Hinge影响酶的催化活性和立体选择性

生物工程学报 2015年第3期31卷 361-374页

作者：梁秋玲吴胜中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室北京100101 中国科学院大学北京100049

Baeyer-Villiger单加氧酶是一种重要的生物催化剂,可用于合成一系列有价值的酯和内酯化合物。通过序列比对和晶体结构分析推测连接NADPH结构域和FAD结构域的一段非保守Hinge可能在酶对底物识别和催化氧化过程中扮演着重要角色。在以环... 详细信息

Baeyer-Villiger单加氧酶是一种重要的生物催化剂,可用于合成一系列有价值的酯和内酯化合物。通过序列比对和晶体结构分析推测连接NADPH结构域和FAD结构域的一段非保守Hinge可能在酶对底物识别和催化氧化过程中扮演着重要角色。在以环己酮单加氧酶为模型的研究中发现,对该Hinge结构进行同源序列替换得到的突变体几乎完全丧失了催化活性,证明了其整体水平的重要性。丙氨酸扫描突变揭示其中一些位点对酶的功能有显著影响:K153位点的改变使酶的活性下降,立体选择性却更优化;L143位点的改变对酶的活性影响较小,却降低了立体选择性;L144位点的改变则同时大幅度削弱酶的活性和立体选择性。将同样的方法运用在苯丙酮单加氧酶中,我们得到了相似的结论,证明这些位点的重要功能在Baeyer-Villiger单加氧酶家族中有一定的普遍性。这一研究增进了对Baeyer-Villiger单加氧酶的结构与功能关系的认识,有助于底物结合口袋的精确描述和Baeyer-Villiger单加氧酶催化图景的进一步细化,对未来相关的理性设计和定向改造研究提供了借鉴。

关键词： Baeyer-Villiger单加氧酶环己酮单加氧酶同源替换丙氨酸扫描突变

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生物合成10-HDA关键催化元件的筛选及P450酶理性设计的研究

生物合成10-HDA关键催化元件的筛选及P450酶理性设计的研究

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作者：李岩齐鲁工业大学

学位级别：硕士

10-羟基-2-癸烯酸(10-Hydroxy-2-decenoic acid,10-HDA)是蜂王浆的重要功能成分,不仅能够增强机体的免疫力,而且在抗肿瘤、抗辐射、抗菌等方面亦有显著功效,其开发潜力广阔,市场需求量大。目前10-HDA仅在蜂王浆中被发现,含量仅为1.4-2.4... 详细信息

10-羟基-2-癸烯酸(10-Hydroxy-2-decenoic acid,10-HDA)是蜂王浆的重要功能成分,不仅能够增强机体的免疫力,而且在抗肿瘤、抗辐射、抗菌等方面亦有显著功效,其开发潜力广阔,市场需求量大。目前10-HDA仅在蜂王浆中被发现,含量仅为1.4-2.4 g/L,且提取成本高昂,供给量难以满足市场需求。虽然设计了多种化学合成10-HDA的方法,但是这些方法工艺路线长、合成条件苛刻,均难以实现规模化生产。随着人民生活水平的不断提高,对功能性天然保健品的需求快速增长,生物合成10-HDA将会有巨大的市场前景。在本研究中,我们以廉价的癸酸作为底物,基于前期课题组对大肠杆菌β氧化途径的改造,即敲除影响反式-2-癸烯酸合成的基因(fad B、fad J、fad R)的基础上,优化筛选反式-2-癸烯酸合成元件:脂酰CoA合成酶(FadD)、脂酰CoA脱氢酶(FadE)、脂酰CoA硫酯酶(YdiI),并对P450酶(CYP153A33-CPR)进行理性设计,提高其对反式-2-癸烯酸末端羟基化转化率,构建了一条从癸酸合成反式-2-癸烯酸,反式-2-癸烯酸末端羟基化最终合成10-HDA的两步法生物转化途径。该途径的第一步反应是利用癸酸合成反式-2-癸烯酸。最初工程菌株(BL21(DE3)-?fad B-?fad J-?fad R/p ET28a-sumo-Ecydi I/p ETDuet-1-Ecfad D-EcfadE)以0.5g/L癸酸为底物时,反式2-癸烯酸产量为37 mg/L,我们以Mycobacterium avium来源的Ma MACS代替Ec FadD,以Pseudomonas putida KT2440来源的Pp FadE代替Ec FadE,同时筛选出6个不同来源的脂酰CoA硫酯酶YdiI同源蛋白,最终选择Cronobacter turicensis来源的Ct YdiI、Salmonella enterica来源的Se YdiI来代替大肠杆菌来源的脂酰CoA硫酯酶Ec YdiI。随后将优化的关键元件进行组合,构建了工程菌株(BL21(DE3)-?fad B-?fad J-?fad R/p ET28a-sumo-Ctydi I/p CDFDuet-1-Ma MACS-PpfadE),通过全细胞催化实验,该工程菌株催化0.5 g/L癸酸可得到0.312g/L反式-2-癸烯酸,转化率达到62.3%,是优化前的工程菌株转化率的8.67倍。该合成途径的第二步反应是以反式-2-癸烯酸在细胞色素P450酶(CYP153A33-CPR)催化下生成终产物10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)。由于野生型CYP153A33-CPR对反式-2-癸烯酸转化率较低,仅为23%,本课题中,我们利用蛋白质理性设计的方法,首先对CYP153A33-CPR与底物间进行分子对接模拟,研究其与底物之间相互作用的关键氨基酸(Gln131、Ile132、Ile131、Val141、Glu142、Met143、Ile145、Ala146、Met228、Ala229、Leu303、Val306、Gly307、Thr311、Leu354、Met357、Cys418和Phe455),并对关键氨基酸中保守性相对低的氨基酸(Gln129、Iie131、Val141、Met143、Met228和Ala229)与底物间结合自由能进行计算,以此为依据对关键氨基酸(Ile131、Met228和Ala229)进行定点突变,其中CYP153A33/M228L基因构建的突变菌株(BL21(DE3)-p ET21b-CYP153A33/M228L-CPR)催化500 mg/L反式-2-癸烯酸得到439 mg/L 10-羟基-2-癸烯酸,转化率为87%,与野生型(BL21(DE3)-p ET21b-CYP153A33-CPR)相比,催化效率提高了3.82倍。分子动力学实验表明,CYP153A33、CYP153A33/M228L与反式-2-癸烯酸的K值分别为3.583×10 M、3.754×10 M,CYP153A33/M228L与反式-2-癸烯酸的K值比CYP153A33与反式-2-癸烯酸的K值小一个数量级。通过以上对合成途径中关键元件的优化和改造,0.5 g/L癸酸经过两步催化能够产生0.275 g/L的10-羟基-2-癸烯酸,转化率为55%。本论文提供了一种以癸酸为底物通过两步全细胞催化癸酸生物合成10-HDA的方法,为10-HDA以及其他中链羟基脂肪酸及不饱和脂肪酸的生物合成提供了新的思路和途径。

关键词： 10-羟基-2-癸烯酸脂酰辅酶A硫酯酶脂酰辅酶A合成酶脂酰辅酶A脱氢酶同源替换细胞色素P450酶理性设计

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