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盐藻PDS基因的同源克隆及在大肠杆菌中的表达

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微生物学报 2015年第2期55卷 149-155页

作者：周峰黄非白林含四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室四川成都610064

【目的】八氢番茄红素脱氢酶PDS为真核膜结合蛋白,我们通过更换不同的表达策略,探索在大肠杆菌中表达真核膜结合蛋白的方式。【方法】利用RACE的方法克隆盐藻PDS的全长c DNA序列。利用原核表达载体p ET-28a构建p ET-28a-PDS表达载体;使... 详细信息

【目的】八氢番茄红素脱氢酶PDS为真核膜结合蛋白,我们通过更换不同的表达策略,探索在大肠杆菌中表达真核膜结合蛋白的方式。【方法】利用RACE的方法克隆盐藻PDS的全长c DNA序列。利用原核表达载体p ET-28a构建p ET-28a-PDS表达载体;使用PLtac启动子替换T7启动子构建p ET-PLtacPDS表达载体;合成Mistic序列融合入p ET-28 a中构建了p ET-Mistic-PDS融合表达载体。分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。【结果】获得了盐藻PDS基因的全长c DNA序列2237 bp,开放阅读框为1749 bp,共编码582个氨基酸(NCBI登录号为GQ923693.1)。利用p ET-28a-PDS和p ET-PLtacPDS表达的PDS蛋白表达量低,并以包涵体形式存在;利用p ET-Mistic-PDS载体表达的PDS蛋白表达量明显提高,且大部分以可溶蛋白形式存在,具有脱氢酶活性。【结论】实验结果表明Mistic作为促溶标签能促进膜蛋白的正确折叠,提高蛋白的可溶性。蛋白酶活测定结果证明了Mistic的融合可以保持蛋白的天然活性。

关键词：盐藻PDS基因同源克隆原核表达 PLtac启动子 Mistic序列

甘蓝型油菜BnGS3和BnGhd7的同源克隆及其与油菜产量相关性状的关系

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作物学报 2018年第2期44卷 297-305页

作者：薛志飞王夏李付鹏马朝芝华中农业大学植物科学技术学院/作物遗传改良国家重点实验室/国家油菜工程技术研究中心湖北武汉430070

甘蓝型油菜为异源四倍体,基因组结构复杂,而水稻基因组与油菜基因组具有一定的共线性。本研究利用水稻产量相关基因GS3和Ghd7序列信息,通过同源克隆方法,获得了甘蓝型油菜的同源基因BnGS3和Bn Ghd7。BnGS3有6个外显子,ORF全长666 bp,编... 详细信息

甘蓝型油菜为异源四倍体,基因组结构复杂,而水稻基因组与油菜基因组具有一定的共线性。本研究利用水稻产量相关基因GS3和Ghd7序列信息,通过同源克隆方法,获得了甘蓝型油菜的同源基因BnGS3和Bn Ghd7。BnGS3有6个外显子,ORF全长666 bp,编码222个氨基酸。BnGS3蛋白具有水稻GS3四个保守结构域中的VWF结构,属于A型。Bn Ghd7含有1个外显子,ORF全长1014 bp,编码337个氨基酸。Bn Ghd7蛋白具有N端的B-Box和C端的CCT两个重要的结构域。BnGS3和Bn Ghd7分别位于A2和A10连锁群,比较测序得到BnGS3的多态性标记brgs-16及Bn Ghd7的多态性标记brghd-3和ghd7-7,其中brghd-3与千粒重(P克隆甘蓝型油菜的同源基因是可行的,为油菜功能基因研究提供了一种有效途径。

关键词：甘蓝型油菜同源克隆产量比较测序相关性分析

结缕草CBF基因的同源克隆及其转基因拟南芥的抗寒性验证

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作物学报 2014年第9期40卷 1572-1578页

作者：冯勋伟才宏伟中国农业大学农学与生物技术学院北京100193 国家知识产权局专利局审查协作北京中心北京100190

结缕草是优良的暖季型草坪草之一,主要用于亚热带和热带地区的草坪种植。抗冷性是结缕草栽培范围的限制因子。本研究以日本最北部原产的结缕草品系为材料,根据其他植物的已知的抗寒基因CBF序列,通过同源克隆的方法获得结缕草中相对应的... 详细信息

结缕草是优良的暖季型草坪草之一,主要用于亚热带和热带地区的草坪种植。抗冷性是结缕草栽培范围的限制因子。本研究以日本最北部原产的结缕草品系为材料,根据其他植物的已知的抗寒基因CBF序列,通过同源克隆的方法获得结缕草中相对应的同源基因ZjCBF;根据和其他已报告的CBF序列的比对结果,确定ZjCBF基因属于CBF转录因子家族基因中CBF1型基因。利用半定量PCR和实时定量PCR分析该基因在寒冷条件下的表达情况,发现ZjCBF基因受冷胁迫的诱导,在4℃处理6 h时表达量最高。在此基础上,本研究构建了该基因的过表达载体,并将其转化到拟南芥中,通过低温冷处理实验发现,不论是否经过冷驯化,转ZjCBF基因植株由于ZjCBF的过量表达均比野生型植株抗寒性强。

关键词：结缕草耐寒性 CBF转录因子同源克隆转基因拟南芥

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甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

作物学报 2015年第3期41卷 499-506页

作者：黄珑苏炜华张玉叶黄宁凌辉肖新换阙友雄陈如凯福建农林大学/农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室/国家甘蔗产业技术研发中心福建福州350002

CIPK （calcineurin B-like-interacting protein kinase）是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫（干旱、高盐、ABA等）的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因（E... 详细信息

CIPK （calcineurin B-like-interacting protein kinase）是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫（干旱、高盐、ABA等）的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因（EU957447.1,2247 bp）核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的cDNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长cDNA序列（GenBank登录号为 KM114052）。序列分析结果表明,甘蔗ScCIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框（ORF,91~1631 bp）,编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域（Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily）。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、NaCl、ABA、SA和MeJA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。

关键词：甘蔗 CIPK基因同源克隆生物信息学实时定量PCR

百萨偃麦草ThbGSK和ThbHKT1基因的同源克隆与表达分析

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麦类作物学报 2013年第2期33卷 209-216页

作者：郭杰庄丽芳亓增军南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室江苏南京210095

百萨偃麦草(Thinopyrum bessarabicum Lve,2n=2x=14,JJ)是小麦改良的重要亲缘物种。为了解GSK和HKT1基因在百萨偃麦草耐盐胁迫中的作用,本研究采用同源克隆的方法从百萨偃麦草中扩增获得了糖原合成酶激酶基因ThbGSK及高亲和性钾离子... 详细信息

百萨偃麦草(Thinopyrum bessarabicum Lve,2n=2x=14,JJ)是小麦改良的重要亲缘物种。为了解GSK和HKT1基因在百萨偃麦草耐盐胁迫中的作用,本研究采用同源克隆的方法从百萨偃麦草中扩增获得了糖原合成酶激酶基因ThbGSK及高亲和性钾离子转运蛋白基因ThbHKT1的全长cDNA,ThbGSK基因全长1 233bp,与水稻、短柄草、小麦等物种的氨基酸一致性为93.92%～99.02%,表明GSK基因在这些物种间具有较高的保守性;聚类分析表明,ThbGSK与小麦TaGSK关系最近。ThbHKT1基因全长1 602bp,与水稻、小麦、短柄草、大麦等物种的氨基酸一致性为66.17%～92.87%,说明HKT1基因在这些物种间变异较大;聚类分析表明,ThbHKT1与大麦HvHKT1关系最近。RT-PCR和荧光定量PCR分析表明,经250mmol.L-1 NaCl胁迫处理后,GSK基因在百萨偃麦草和中国春诱导0～24h的叶片中表现为组成型表达,而HKT1基因在百萨偃麦草和中国春中均表现为诱导后上调表达。

关键词：百萨偃麦草 GSK基因 HKT1基因同源克隆基因表达

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小麦铁结合蛋白基因的同源克隆

麦类作物学报 2008年第1期28卷 25-30页

作者：赵永亮周荣华贾继增河南工业大学生物工程学院河南郑州450001 中国农科院作物科学研究所农业部品种资源重点实验室北京100081

为了寻找一种简捷的克隆同源基因的途径,以小麦铁蛋白基因的同源克隆为例,利用玉米的铁结合蛋白基因序列比对小麦的EST库,在网上进行电子延伸后以起始密码子为起点,终止密码子为终点设计特异性强的引物进行基因克隆,经过引物O1和Fcds扩... 详细信息

为了寻找一种简捷的克隆同源基因的途径,以小麦铁蛋白基因的同源克隆为例,利用玉米的铁结合蛋白基因序列比对小麦的EST库,在网上进行电子延伸后以起始密码子为起点,终止密码子为终点设计特异性强的引物进行基因克隆,经过引物O1和Fcds扩增片段的测序及Blast比对,证实本试验已成功地从小麦的基因组和cDNA中克隆出铁结合蛋白基因。最后对基于同源序列克隆基因的策略及引物设计技巧进行了探讨。

关键词：小麦铁结合蛋白基因引物设计同源克隆

大麦幼穗MLOC-14401基因编码区的同源克隆和序列分析

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云南农业大学学报（自然科学版） 2018年第1期33卷 1-6页

作者：彭澎王楠陈升位王家曦沈真辉李静烨王新天云南农业大学农学与生物技术学院云南昆明650201

【目的】编码区序列是基因作用机制、遗传多样性和进化关系等研究的重要资源。【方法】以盐城红茎大麦、青田红大麦、淳安六棱胭脂大麦和北青7号为材料,采用同源克隆技术分离、克隆MLOC-14401基因CDS序列,利用ORF Finder、BLAST和Clusta... 详细信息

【目的】编码区序列是基因作用机制、遗传多样性和进化关系等研究的重要资源。【方法】以盐城红茎大麦、青田红大麦、淳安六棱胭脂大麦和北青7号为材料,采用同源克隆技术分离、克隆MLOC-14401基因CDS序列,利用ORF Finder、BLAST和Clustal X等软件分析所克隆的CDS序列。【结果】MLOC-14401基因CDS序列全长1 248 bp、包含3个外显子、GC含量为62.82%,位于大麦3H染色体的609 892 778~609895 303 bp区间,起始密码(ATG)和终止密码序列(TAA)分别位于119 bp和1 366 bp位点。所编码多肽链包含415个氨基酸、2个MYB结构域,与普通小麦等9个物种的MYB基因编码多肽链具有不同程度的氨基酸序列相似性,保守序列位于105氨基酸与237氨基酸之间。【结论】MLOC-14401基因属大麦转录调控基因R2R3-MYB,所克隆的CDS序列对于大麦MYB基因作用机制等研究具有一定指导作用。

关键词：大麦 MLOC-14401基因编码区同源克隆序列分析

治疗性与生殖性克隆的分水岭——同源克隆实验评介

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基础医学与临床 2005年第5期25卷 390-391页

作者：向若兰章静波中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所北京100005

韩国科学家把从卵丘细胞中提取的DNA注入到同一位女性的无核卵细胞中去,并能发育至胚泡期,增殖细胞近100个,这就是“同源克隆”。这次的克隆十分成功,没有发现染色体的丢失或异常表达。同源克隆属于治疗性克隆,它的目的是建立胚胎干细胞... 详细信息

韩国科学家把从卵丘细胞中提取的DNA注入到同一位女性的无核卵细胞中去,并能发育至胚泡期,增殖细胞近100个,这就是“同源克隆”。这次的克隆十分成功,没有发现染色体的丢失或异常表达。同源克隆属于治疗性克隆,它的目的是建立胚胎干细胞系,让它们发育成为有特殊功能的细胞群,用于治疗。而生殖性克隆的目的则是培养出一个完整的胎儿,此类克隆有悖于伦理学道德,是人们应该严肃、慎重对待的问题。

关键词：生殖性克隆同源克隆分水岭实验胚胎干细胞系治疗性克隆卵丘细胞增殖细胞异常表达卵细胞 DNA 科学家胚泡期染色体细胞群伦理学发育

梭菌氢酶基因部分片段的同源克隆及敲除载体的构建

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西北农业学报 2012年第7期21卷 61-66页

作者：闫倩闫苗章王保莉曲东西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100 西北农林科技大学资源环境学院陕西杨凌712100

为从分子水平探索典型铁还原菌-梭菌的铁还原能力与其氢酶产氢之间的关系,以从水稻土中分离得到一株具有高铁还原能力和高产氢能力的梭菌为材料,通过同源克隆获得长度为761bp氢酶基因的部分序列。生物信息分析发现,该基因片段覆盖氢酶... 详细信息

为从分子水平探索典型铁还原菌-梭菌的铁还原能力与其氢酶产氢之间的关系,以从水稻土中分离得到一株具有高铁还原能力和高产氢能力的梭菌为材料,通过同源克隆获得长度为761bp氢酶基因的部分序列。生物信息分析发现,该基因片段覆盖氢酶的活性中心,是氢酶的主要功能结构域。采用Overlap PCR的方法构建含有四环素抗性基因的氢酶基因敲除载体(pMD-19-HTH),以期进一步构建氢酶基因缺失的梭菌突变体,为分析氢酶产氢与铁还原的关系奠定基础。

关键词：氢酶同源克隆重叠PCR 敲除载体