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CD4同源二聚化或寡聚化的间接检测及其介导的生物学功能的初步分析

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生物工程学报 2005年第2期21卷 239-243页

作者：肖鹤李松沈倍奋黎燕军事医学科学院基础医学研究所北京100850 军事医学科学院毒物药物研究所北京100850

近年来的研究表明 ,CD4分子于细胞膜表面不仅以单体形式存在还可以通过其D4和D1形成同源二聚化及寡聚化 ,并且二聚化及寡聚化的CD4分子才能稳定地与MHC Ⅱ类分子结合。通过分析CD4分子以及CD4缺失突变体分子融合Fas基因片段所诱导的转... 详细信息

近年来的研究表明 ,CD4分子于细胞膜表面不仅以单体形式存在还可以通过其D4和D1形成同源二聚化及寡聚化 ,并且二聚化及寡聚化的CD4分子才能稳定地与MHC Ⅱ类分子结合。通过分析CD4分子以及CD4缺失突变体分子融合Fas基因片段所诱导的转染靶细胞的凋亡 ,以及携带绿色荧光蛋白的CD4分子转染HEK2 93细胞所筛选出的稳定克隆的不同荧光强度和与MHC Ⅱ类分子阳性细胞Raji之间的不同黏附效应间接鉴定CD4同源二聚体或寡聚体的存在 ,并对二聚化或寡聚化CD4分子所介导的生物学功能进行初步分析。

关键词：同源二聚化间接检测激光共聚焦细胞黏附玫瑰花环缺失突变

G蛋白偶联受体激酶6同源二聚化的机制及其对胞膜定位的影响

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G蛋白偶联受体激酶6同源二聚化的机制及其对胞膜定位的影响

作者：沈珂桂林医学院

学位级别：硕士

目的:G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinases,GRKS)通过特异性地磷酸化配体激活的G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors,GPCRS),快速“关闭”或“减敏(desensitization)”激动剂持续引发的信号传导,从而调控GPCR介导的各种生理病理活动。GRK6属于GRK4亚家族成员,在调节细胞功能代谢以及神经元退行性变中发挥重要作用。GRK6晶体结构显示,在氨基端区的G蛋白信号调节子(RGS)结构域中存在一个由Ile39、Met165、Tyr166和Phe527 4个疏水性氨基酸组成的同源二聚化作用界面,人工突变这些氨基酸残基导致GRK6蛋白的激酶活性显著降低。因此,二聚化可能是GRK6调控GPCR的重要机制之一。迄今为止,还未有GRK在细胞内形成二聚体的报道。另一方面,定位细胞膜是GRK调控GPCR信号通路的前提条件,而GRK6分子同源二聚化对其胞膜定位的影响目前还不清楚。本研究旨在揭示GRK6在细胞内同源二聚化的现象与机制、及其对GRK6胞膜定位的影响。方法:首先,本实验采用竞争性双分子荧光互补(BiFC-C)方法,在共转染融合质粒pBiFC-GRK6-VN173/pBiFC-GRK6-VC155基础上加入GRK6-mCherry及pmCherry-N1至HEK293细胞中,检测BiFC荧光信号改变。联合荧光共振能量转移(FRET)技术,将融合质粒GRK6-GFP/GRK6-mCherry与对照组Gi(1-10)-GFP/GRK6-mCherry分别共转染入HEK293细胞中,在激光共聚焦扫描显微镜下以受体光漂白法分析GRK6分子的FRET效率,观察GRK6的同源二聚化现象。其次,人工突变GRK6的Met165、Tyr166和Phe527三个氨基酸残基,构建GRK6二聚化界面突变子(GRK6EED)BiFC和FRET质粒,检测突变体与野生型GRK6的BiFC荧光信号及FRET效率的改变,评判其是否为GRK6的同源二聚化界面的关键基团。最后,在荧光显微镜下观察突变体与野生型GRK6分子的胞膜定位。结果:在GRK6-VN173+GRK6-VC155共表达组检测到显著的BiFC阳性信号;其阳性信号的细胞数量和BiFC信号强度可被GRK6-mCherry竞争分子显著抑制。在GRK6-GFP与GRK6-mCherry分子之间检测到显著的FRET信号;转染突变质粒组的BiFC信号阳性细胞数和信号强度均显著低于野生型GRK6;突变体的FRET信号较野生型对照组显著降低。最后,Met165、Tyr166和Phe527突变的GRK6分子失去胞膜定位能力,主要分布于胞浆。结论:研究结果表明,GRK6在细胞内能够形成同源二聚体,Met165、Tyr166和Phe527可能是GRK6分子同源二聚化作用界面的关键基团,并对GRK6的胞膜定位起重要作用。本研究为证实GRK6在细胞内发生同源二聚化提供了直接证据,为深入研究GRK6的亚细胞分布调控机制提供了新线索。

关键词： GRK6 同源二聚化胞膜定位信号转导

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诱导同源蛋白质二聚化的方法

生物化学与生物物理进展 2024年

作者：郭俊霞刘森湖北工业大学生命科学与健康工程学院工业发酵省部共建协同创新中心湖北微生元生物科技有限公司湖北工业大学生命科学与健康工程学院发酵工程教育部重点实验室

同源蛋白质二聚化是一种普遍的现象，在许多生物过程中发挥着关键作用。多数细胞事件，如信号转导、转录辅因子募集、酶激活，甚至致病途径，都通过同源蛋白质-蛋白质相互作用受到显著调节。调控同源蛋白质二聚化过程和了解其分子机制... 详细信息

同源蛋白质二聚化是一种普遍的现象，在许多生物过程中发挥着关键作用。多数细胞事件，如信号转导、转录辅因子募集、酶激活，甚至致病途径，都通过同源蛋白质-蛋白质相互作用受到显著调节。调控同源蛋白质二聚化过程和了解其分子机制对于生物医学应用以及剖析复杂的生物调控网络至关重要。邻近效应或分子的物理接近效应是生物过程中必不可少的调节因素，可以通过诱导二聚化方法来控制。基于临近诱导的化学诱导二聚化（chemically induced dimerization， CID）系统与光诱导二聚化（light induced dimerization， LID）系统为调节二聚化蛋白质的功能提供了强大的工具，并得到逐步发展。近年来，金属离子、核酸和分子主客体系统被提出作为正交控制同源蛋白质二聚化的新方法。本综述阐述了通过CID系统、LID系统以及超分子化学的手段诱导同源蛋白质二聚化的方法与应用，以期为今后同源蛋白质二聚化的应用发展提供一些参考与思路。

关键词：蛋白质-蛋白质相互作用邻近诱导同源二聚化化学诱导二聚化光诱导二聚化

荧光互补与光能量共振转移检测B类G蛋白偶联受体PAC1二聚化

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中国细胞生物学学报 2012年第10期34卷 1023-1029页

作者：郭晓令余榕捷钟佳萍李梅曾智星刘晓飞暨南大学生命科学技术学院生物医药研究院广州510632

G蛋白偶联受体(G-protein couple receptors,GPCRs)是最大的超家族膜受体,其中它的B家族成员垂体腺苷酸环化酶激活肽1(PAC1)是垂体腺苷酸环化酶激动多肽(PACAP)的特异受体,介导PACAP神经保护等功能,是神经系统疾病药物开发的重要靶点之... 详细信息

G蛋白偶联受体(G-protein couple receptors,GPCRs)是最大的超家族膜受体,其中它的B家族成员垂体腺苷酸环化酶激活肽1(PAC1)是垂体腺苷酸环化酶激动多肽(PACAP)的特异受体,介导PACAP神经保护等功能,是神经系统疾病药物开发的重要靶点之一。二聚化或寡聚化是GPCRs普遍存在的现象,但是目前尚没有关于PAC1形成同源二聚体或寡聚体的报道。为了验证PAC1也能进行同源二聚化,该文采用生物发光能量转移(bioluminescence resonance energy transfer,BRET)方法进行检测,结果显示不同浓度梯度共转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)的PAC1-Rluc与PAC1-EYFP重组载体,在底物腔肠素h(coelenterazine h)作用下呈现明显的BRET信号。双分子荧光互补(BiFC)检测显示,带有EYFP N端基因标记的PAC1与带有EYFP C端基因标记的PAC1共转染CHO细胞,能呈现完整的EYFP荧光信号。同时,Western blot检测也显示,高表达PAC1的细胞中可检测到PAC1二聚体的大分子。因此,PAC1是能够进行正常同源二聚化的,这个发现将为后续神经损伤药物的开发奠定全新的理论基础,同时也为其他GPCRs同源二聚化的研究起到启发和借鉴作用。

关键词： GPCRs PAC1 同源二聚化

鼠表皮生长因子受体胞外段原核表达、纯化与复性

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生物医学工程学杂志 2003年第2期20卷 264-267页

作者：胡兵田聆卢铀杨莉赵霞刘继彦魏于全四川大学华西医院教育部人类疾病生物治疗重点实验室与肿瘤中心成都610041 四川大学华西二医院成都610041

用多聚酶链反应 (PCR)方法从既往构建质粒扩增鼠表皮生长因子受体 (EGFR)胞外段基因及适宜酶切位点 ,进而构建原核表达载体。克服质粒丢失的不足 ,在大肠杆菌中表达目的蛋白 ,并在变性条件下通过 Ni2 +柱亲和层析纯化表达蛋白 ,聚丙烯... 详细信息

用多聚酶链反应 (PCR)方法从既往构建质粒扩增鼠表皮生长因子受体 (EGFR)胞外段基因及适宜酶切位点 ,进而构建原核表达载体。克服质粒丢失的不足 ,在大肠杆菌中表达目的蛋白 ,并在变性条件下通过 Ni2 +柱亲和层析纯化表达蛋白 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS- PAGE)示纯度在 95 %以上。去除组氨酸标记的纯化蛋白在梯度尿素中透析复性。复性蛋白在表皮生长因子的作用下可以同源二聚化而在非还原 SDS- PAGE及蛋白印迹分析中呈二聚体状态 ,其所产生抗体可以识别复性蛋白及表达于肺癌细胞上的 EGFR,提示复性后大肠杆菌表达鼠EGFR胞外段重组蛋白已获得一定空间结构 ,并具有免疫原性 ,可以进一步用于

关键词：表皮生长因子受体原核表达纯化同源二聚化免疫原性基因扩增胞外段肿瘤