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Streptomyces lincolnensis新遗传操作方法的建立以及lmbQ基因功能研究

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生物技术通报 2010年第11期26卷 186-190,198页

作者：王增亮赵群飞高淑红陈长华刘文华东理工大学生物工程学院上海200237 中国科学院上海有机化学研究所上海200032

以载体pSET152和pKC1139为出发质粒,通过供体菌大肠杆菌ET12567和S17-1转入林可链霉菌(Streptomyces lincolnensis),建立和优化了接合转移体系。林可霉素生物合成基因簇中,lmbQ基因可能编码一个调控蛋白,构建了***-colnensislmbQ基因中... 详细信息

以载体pSET152和pKC1139为出发质粒,通过供体菌大肠杆菌ET12567和S17-1转入林可链霉菌(Streptomyces lincolnensis),建立和优化了接合转移体系。林可霉素生物合成基因簇中,lmbQ基因可能编码一个调控蛋白,构建了***-colnensislmbQ基因中断载体,通过接合转移导入***野生型菌株,筛选得到基因双交换突变株,通过PCR以及测序验证基因型正确,该突变株即为lmbQ同框敲除突变株。摇瓶发酵结果表明,lmbQ基因是一个正调控基因。

关键词：林可链霉菌林可霉素属间接合转移 lmbQ基因同框敲除

金色链霉菌功能基因的研究及高产去甲金霉素菌株的构建

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金色链霉菌功能基因的研究及高产去甲金霉素菌株的构建

作者：谭彦英华东理工大学

学位级别：硕士

去甲金霉素是金色链霉菌产生的天然四环类抗生素,具有广谱性,主要作为中间体合成新型的四环类抗生素以解决细菌的耐药性问题,具有市场应用价值。本课题在分子水平上阐释与金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)去甲金霉素合成相关的三... 详细信息

去甲金霉素是金色链霉菌产生的天然四环类抗生素,具有广谱性,主要作为中间体合成新型的四环类抗生素以解决细菌的耐药性问题,具有市场应用价值。本课题在分子水平上阐释与金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)去甲金霉素合成相关的三个基因:ctcK(结构基因),ctcB(调控基因)和ctcC(抗性基因)。通过同框敲除和过表达的分子生物学手段构建基因缺失突变株和过表达菌株,分析突变株对去甲金霉素合成的影响,以此不仅揭示基因的功能,而且获得高产去甲金霉素的菌株。根据金霉素和去甲金霉素在结构上只相差一个C6位的甲基以及推测金霉素合成基因簇中ctcK编码C6位的甲基化酶,在产金霉素菌株CT1中构建了 ctcK基因缺失突变株△ctcK。经HPLC和LC-MS分析,相比CT1所产3765 μg/mL的金霉素和230 μg/mL的四环素,突变株△ctcK则积累了 376μg/mL去甲四环素、432 μg/mL去甲金霉素以及残存少量的金霉素,而回补ctcK的菌株CctcK则恢复生产金霉素(328 μg/mL)和四环素(421μg/mL),这充分说明了ctcK的功能。通过qRT-PCR发现突变株△ctcK的ctcV表达量却高于CT1,推测突变株△ctcK抗生素产量低的原因是存在类黑色素。根据ctcB为金霉素合成基因簇的SARP家族调控子,在产去甲金霉素菌株DT1中构建ctcB基因缺失突变株△ctcB和过表达菌株ctcB+。突变株△ctcB的去甲金霉素产量从3578 μg/mL降至1568 μg/mL,而突变株ctcB+则提高至5068 μg/mL,相比DT1提高了 41%,这说明ctcB正向调控去甲金霉素产量。通过qRT-PCR分析,过表达ctcB会提高合成基因簇中ctcH,ctcN,ctcQ,ctcC,ctcG,ctcV的转录水平,进一步阐释途径特异性调控子ctcB的调控机理。通过生物信息学预测分析了 CtcB蛋白结合DNA区域的特征。根据对ctcC抗性基因的功能预测,在产去甲金霉素菌株DT1中构建了 ctcC基因过表达菌株ctcC+,其去甲金霉素产量提高至3818μg/mL,提高了 9%。通过qRT-PCR分析,突变株ctcC+的ctcC表达量是DT1的2.2倍,说明突变株ctcC+中去甲金霉素产量提升是因为过表达了 ctcC导致的。

关键词：金色链霉菌去甲金霉素同框敲除 SARP 抗性基因

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林可霉素生物合成基因功能研究

林可霉素生物合成基因功能研究

作者：王增亮华东理工大学

学位级别：硕士

林可霉素和它的衍生物是一类对革兰氏阳性菌有明显抑制作用的抗生素。本研究中我们建立并优化了大肠杆菌-林可链霉菌(S. lincolnensis)属间接合转移系统,利用温度敏感型穿梭质粒pKC1139,甲基化缺失的的*** ET12567作为供体菌,通过接合... 详细信息

林可霉素和它的衍生物是一类对革兰氏阳性菌有明显抑制作用的抗生素。本研究中我们建立并优化了大肠杆菌-林可链霉菌(S. lincolnensis)属间接合转移系统,利用温度敏感型穿梭质粒pKC1139,甲基化缺失的的*** ET12567作为供体菌,通过接合转移至S. lincolnensis中。以pJTU2554为载体,构建了能覆盖S. lincolnensis所有基因的全基因组文库,并通过基于PCR筛选的方法得到了能包含林可霉素整个生物合成基因簇的黏粒1E8。林可霉素的生物合成基因簇存在于大约35kb染色体区域上,包含27个推定的生物合成及调控基因(lmb基因)和3个抗性基因(lmr基因)。我们利用同框敲除的策略,对3个推定的调控基因lmbIH, lmbQ和lmbU进行中断。摇瓶发酵结果显示所有的突变株产林可霉素能力均大幅下降,表明这三个基因可能都是正调控基因。将3个推定的甲基化酶基因lmbM1、lmbM2和lmbM3进行了同框敲除。对lmbM1基因中断突变株发酵的中间产物进行分离纯化并通过核磁共振鉴定结构,确定是林可霉素B,这为lmbM1基因功能的推断提供了十分重要的证据。lmbM3中断突变株产生的中间产物进行了初步分离。lmbM2基因中断突变株失去林可霉素产生能力,表明该基因与林可霉素生物合成直接相关。

关键词：林可链霉菌林可霉素属间接合转移生物合成同框敲除

基于基因组信息的深海放线菌Streptomyces koyangensis SCSIO 5802中次级代谢产物的挖掘

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基于基因组信息的深海放线菌Streptomyces koyangensis SCSIO 580...

作者：涂佳佳遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:Streptomyces koyangensis SCSIO 5802是分离自南海底泥沉积物的一株放线菌,研究发现在常规实验室条件下发酵分离得到的化合物不仅对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)具有较强的抑制活... 详细信息

目的:Streptomyces koyangensis SCSIO 5802是分离自南海底泥沉积物的一株放线菌,研究发现在常规实验室条件下发酵分离得到的化合物不仅对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)具有较强的抑制活性,还具有细胞毒性。本论文以*** SCSIO 5802为研究对象,利用基因敲除、基因激活、培养条件优化等方法进一步挖掘该菌株生产次级代谢产物的潜力。方法:首先,采用Illumina Miseq结合第三代测序技术对*** SCSIO5802菌株的基因组测序,得到该菌株的完成图,利用生物信息学方法分析*** SCSIO 5802全基因组序列,并使用antiSMASH在线软件进行基因注释(http://***/);第二,利用PCR-targeting的方法对负责abyssomicin类和candicidin类化合物的生物合成的聚酮合酶基因abmB1和canD进行同框缺失,获得基因工程菌株*** SCSIO 5802AC;第三,利用发酵优化的手段对*** SCSIO 5802AC菌株的次级代谢产物进行挖掘;最后,在*** SCSIO 5802AC工程菌株的基础上进一步激活5802基因组中沉默生物合成基因簇。结果:1.通过对*** SCSIO 5802的全基因组进行扫描测序,结果显示*** SCSIO 5802基因组长约6.86 Mb,GC含量为73.4%,含有6419个编码基因,75个tRNA和3119个rRNA,利用在线生物信息学软件antiSMASH分析,基因组上共含有21个生物合成基因簇。2.利用基因敲除的方法对abyssomicins/neoabyssomicins类化合物的生物合成聚酮合酶基因abmB1进行同框缺失突变,得到双交换突变株SCSIO 5802A,从而激活了candicidin类化合物的产生。通过生物信息学方法鉴定了candicidin类化合物的生物合成基因簇,推导了其可能的生物合成途径;在此基础上,以基因突变株SCSIO 5802A为出发菌株,对candicidin化合物的聚酮合酶基因canD再次进行同框缺失突变,最终得到了既不生产abyssomicins/neoabyssomicins类化合物也不生产candicidin类化合物的背景干净、代谢流清晰的突变株*** SCSIO 5802AC,该菌株用于后续次级代谢产物的挖掘。3.采用11种培养基对*** SCSIO 5802AC菌株进行发酵优化,通过对发酵结果进行HPLC分析,其中R5培养基、Hmt培养基、P2培养基和A1培养基在19 min左右出现一个新峰,该化合物在500 nm处有最大紫外吸收。4.以遗传背景干净、代谢流清晰的菌株*** SCSIO 5802AC为基础菌株。利用PCR-targeting技术和属间接合转移技术,成功实现了红霉素强启动子在6个基因簇的结构基因或者调控基因前的添加。突变株发酵结果经HPLC-DAD分析,发现激活了可能编码herboxidiene类化合物的表达。结论:通过基因敲除、培养基优化、基因簇骨架基因前强启动子的添加可以有效挖掘*** SCSIO 5802菌株中产生的次级代谢产物。

关键词： S.koyangensis SCSIO 5802 同框敲除基因簇激活发酵优化次级代谢产物

代谢工程改造***工业菌株优化欧典螺旋霉素发酵组分

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作者：刘德玉华东理工大学

学位级别：硕士

生二素链霉菌能够合成大环内酯类抗生素螺旋霉素。负责螺旋霉素生物合成的基因序列大部分已经被测序,通过对一些功能基因的序列的比对,我们发现了可能具有编码大环氧化修饰酶功能的两个基因orfl和orf31;可能编码负责N-二甲基转移酶功能... 详细信息

生二素链霉菌能够合成大环内酯类抗生素螺旋霉素。负责螺旋霉素生物合成的基因序列大部分已经被测序,通过对一些功能基因的序列的比对,我们发现了可能具有编码大环氧化修饰酶功能的两个基因orfl和orf31;可能编码负责N-二甲基转移酶功能的两个基因orf1*c和orf9c。在本实验中,我们首先确定了生二素链霉菌本身拥有的两种抗性,选择得到了大肠杆菌E. coli S17-1-生二素链霉菌的高效转移体系。挑选得到了包含螺旋霉素生物合成有关的基因片段的文库。得到了基因倍增突变株***-orfl, ***-orfl*c和***-orf31,其中***-orf1*c和***-orf31突变株削弱了对m/z为875杂质的生产能力,***-orfl突变株只在一定程度上减少了螺旋霉素整体的生产能力。得到基因敲除突变株L-D1, L-D1*c, L-D9c和L-D31, L-D9c得到了m/z为815的中间代谢物,其他的三株敲除突变基本上丧失了对螺旋霉素及一些相关代谢物的生产能力。

关键词：螺旋霉素生二素链霉菌属间接合转移基因倍增同框敲除

林可霉素生物合成基因簇中调控基因lmbU的功能研究

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化学与生物工程 2011年第11期28卷 37-41页

作者：陈林王增亮赵群飞高淑红叶蕊芳华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237 中国科学院上海有机化学研究所上海200032

研究了林可霉素生物合成基因簇中调控基因lmbU的功能。通过构建重组质粒pLIN-DU和pLIN-U分别对林可霉素工业生产菌株Streptomyces lincolnensis的lmbU基因进行同框敲除和基因倍增,获得相应突变菌LIN-DU和LIN-U后,对突变菌发酵液进行生... 详细信息

研究了林可霉素生物合成基因簇中调控基因lmbU的功能。通过构建重组质粒pLIN-DU和pLIN-U分别对林可霉素工业生产菌株Streptomyces lincolnensis的lmbU基因进行同框敲除和基因倍增,获得相应突变菌LIN-DU和LIN-U后,对突变菌发酵液进行生物效价测定和LC-MS分析,探讨lmbU基因对林可霉素产量和组分的影响。结果发现,基因敲除突变菌LIN-DU的林可霉素生物合成能力大幅削弱;基因倍增突变菌LIN-U的林可霉素生物合成相对出发菌株没有明显变化。表明lmbU基因对林可霉素生物合成具有正向调控作用。

关键词：林可链霉菌林可霉素 lmbU基因同框敲除基因倍增