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园艺学报 2025年

作者：荆永琳陈浪欣李俊国王加宾王小冰杨庆全孟春阳徐立中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所农业农村部华南作物基因资源与种质创制重点实验室海南省热带作物资源遗传改良与创新重点实验室国家热带作物中期库

以菠萝‘台农16’为材料，克隆得到基因AcKNOX1。AcKNOX1是同源异型盒基因，属于3个氨基酸环延伸蛋白超家族。AcKNOX1的开放阅读框为990 bp，编码329个氨基酸，编码蛋白定位于细胞核中。AcKNOX1启动子区域除核心启动子元件TATA-box和CAA... 详细信息

以菠萝‘台农16’为材料，克隆得到基因AcKNOX1。AcKNOX1是同源异型盒基因，属于3个氨基酸环延伸蛋白超家族。AcKNOX1的开放阅读框为990 bp，编码329个氨基酸，编码蛋白定位于细胞核中。AcKNOX1启动子区域除核心启动子元件TATA-box和CAAT-box外，还包含许多与光响应、激素响应和非生物胁迫响应相关的元件。AcKNOX1在不同组织中均有表达，但具有明显的组织表达特异性，在茎的表达量最高，其次是叶，且在有刺叶片显著高于无刺叶片。AcKNOX1响应GA3、ABA和6-BA信号诱导其表达上调。异源表达拟南芥，叶缘裂刻加深。利用酵母单双杂进行互作蛋白筛选，发现AcKNOX1可以与AcCUC1和AcCUC2启动子区域结合激活其表达；与AcBLH1、AcBLH4可形成异源二聚体，在细胞核中互作，且荧光素酶互补和双分子荧光互补实验验证了其互作的准确性。研究结果表明AcKNOX1在菠萝叶缘发育中起重要作用。

关键词：菠萝叶缘发育 AcKNOX1 蛋白互作

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森林草莓叶片和心皮异常突变体FveMIR164A基因的克隆与分析

森林草莓叶片和心皮异常突变体FveMIR164A基因的克隆与分析

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作者：魏薇华中农业大学

学位级别：硕士

森林草莓(Fragaria vesca)是蔷薇科草莓属的二倍体野生种,因其具有基因组小、植株矮小、生长周期短、日中性开花、易进行遗传转化等多种优势,已逐渐成为八倍体栽培草莓的模式植物。又因蔷薇科植物具有相似的花结构,森林草莓也成为了研... 详细信息

森林草莓(Fragaria vesca)是蔷薇科草莓属的二倍体野生种,因其具有基因组小、植株矮小、生长周期短、日中性开花、易进行遗传转化等多种优势,已逐渐成为八倍体栽培草莓的模式植物。又因蔷薇科植物具有相似的花结构,森林草莓也成为了研究其他蔷薇科植物花发育的良好模型。花果发育与果树作物的产量和品质息息相关,但是我们对其调控机制知之甚少。通过突变体克隆和发掘基因是功能基因组学研究的经典方法,也是寻找花果发育关键基因的有效手段。本研究以野生型森林草莓Yellow Wonder 5AF7(YW5AF7)及EMS诱导的叶片和心皮异常发育突变体p3为主要材料,通过表型鉴定、遗传分析、致突变基因克隆和功能验证、筛选和分析下游靶基因等方法探究该基因在森林草莓叶片和心皮发育中的重要功能,为进一步解析森林草莓叶片和花发育的分子机制奠定基础。主要研究结果如下:1.与野生型YW5AF7相比,p3突变体具有多种表型,包括部分叶片小叶明显分离、叶缘锯齿加深且皱缩、萼片和花瓣边缘产生锯齿或缺刻、雄蕊数量减少到一半左右、超过50%的心皮具有2-3个畸形花柱、几乎不能正常授粉受精以及花托不能正常膨大。扫描电镜观察发现花发育到第11时期时即出现额外的花柱组织。2.遗传学分析发现p3的异常表型是由单基因控制的隐性突变导致,并可稳定遗传。我们对回交F群体进行分组和混池基因组重测序,发现候选基因编码miR164,其成熟序列第19位碱基发生G到A的突变,暂将此基因命名为FveMIR164A。对来自F群体的68株突变体进行单株Sanger测序,发现目标SNP均为纯合。序列比对分析发现该位点在39种植物的131条miR164序列中非常保守。3.为了验证突变位点的重要性,我们构建了野生型和突变型的超表达载体35S::FveMIR164A和35S::FveMIR164A,并分别转入野生型拟南芥(Col)中。结果显示,35S::FveMIR164A能导致拟南芥子叶和莲座叶发生融合、叶缘锯齿消失和无法结籽等多种表型;但35S::FveMIR164A未引起显著变化。将35S::FveMIR164A稳定转入森林草莓p3突变体中,阳性转基因苗同样出现叶缘锯齿消失和小叶融合的表型,该叶片表型与p3完全相反;因其还未开花,暂无法观察花器官表型。遗传学实验表明突变体p3的致突变基因即为FveMIR164A。4.预测FvemiR164A有6个靶基因,分别编码了不同的NAC转录因子,靶位点位于编码区。qPCR分析表明,各靶基因在p3突变体的幼嫩叶片和发育早期的心皮中均较YW5AF7有不同程度的上调。利用已有的一个靶基因EMS突变体fvecuc2构建双突变体fvemir164afvecuc2,观察发现双突变植株叶片和心皮形态结构均与fvecuc2一致,说明FveCUC2是介导FvemiR164A调控森林草莓叶片和心皮发育的关键靶基因。

关键词： microRNA(miRNA) CUC2 叶缘发育花柱发育多花柱

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菠萝叶刺形成相关基因的分离与鉴定

菠萝叶刺形成相关基因的分离与鉴定

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作者：荆永琳海南大学

学位级别：硕士

菠萝(Ananas comosus)是热带多年生草本果树,世界重要热带水果之一。部分菠萝品种叶片边缘常有叶刺,给田间管理和栽培采收带来诸多不便,培育无刺品种是菠萝育种的重要目标之一。本文以菠萝台农16号为试材,基于转录组测序数据获得7 个与... 详细信息

菠萝(Ananas comosus)是热带多年生草本果树,世界重要热带水果之一。部分菠萝品种叶片边缘常有叶刺,给田间管理和栽培采收带来诸多不便,培育无刺品种是菠萝育种的重要目标之一。本文以菠萝台农16号为试材,基于转录组测序数据获得7 个与菠萝叶刺形成相关的基因:AcBLH2(Ananas comosus BELl-like homeodomain protein 2)、AcLBD15(Ananas cowosus LOB dowain-containing protein 15)、AcKNOX1(Ananas comosus homeotic protein knotted-1-like)、AcSPL14(Ananas comosus squamosa promoter-binding-like protein 14)、AcTBL1 9(Ananas comosus protein trichome birefringence-like 19)、AcWAT1(Ananas comosus protein WALLS ARE THIN 1)和AcWOX3(Ananas comosus WUSCHEL-relatedhomeobox 3-like)。荧光定量进一步分析,在菠萝不同形态的叶缘中存在差异表达的基因有5个:AcBLH2、AcLBD15、AcKNOX1、AcSPL14、AcTBL19。对以上目标基因进行生物信息学分析、表达模式分析,构建过表达载体,转化模式植物拟南芥进行功能鉴定,初步阐明了菠萝叶刺形成相关基因在叶形发育中的作用,主要研究结果如下:1、分别在菠萝有叶刺、无叶刺叶边缘中成功分离7个菠萝叶刺形成相关基因的全长cDNA序列,结果发现这7个基因在不同叶缘中的基因序列几乎无差异,根据NCBI网站上的预测序列名称将其分别命名为AcBLH2、AcLBD15、AcKNOOX1、AcSPL14、AcTBL19、AcWAT1 和 AcWOX3。2、实时荧光定量(qRT-PCR)分析7个菠萝叶刺形成可能相关的基因在菠萝不同品种、不同叶缘中的相对表达量,结果显示在同一品种不同形态的叶缘中表达量显著差异的基因有 5 个:AcBLH2、AcLBD15、AcKNOX1、AcSPL14、AcTBL19,无明显差异的基因有2个:AcWAT1和AcWOX3;AcBLH2、AcLBD15和AcTBL19基因在两个品种无叶刺菠萝叶边缘中相对表达量均显著高于有叶刺菠萝,而AcKNOX1、AcSPL14基因在两个品种无叶刺菠萝叶边缘中相对表达量均显著低于有叶刺菠萝,5个差异基因在两个品种的不同叶缘中表达量差异呈现一致性,表明品种差异不会影响这5个基因在不同形态叶缘的表达量差异。另外,荧光定量分析了 7个相关基因的时空特异性表达,除AcBLH2基因在菠萝叶中表达量最高以外,其它6个基因均在菠萝茎中表达量最高。3、通过对5个差异基因编码的蛋白质进行结构域分析,显示5个基因均具有各自相应基因家族的保守结构域,功能具有一定的保守性。系统进化树分析显示BLH、SPL14基因家族中没有与菠萝亲缘关系较近的物种;KNOX1、LBD15、TBL19基因家族中与菠萝亲缘关系较近的均是海枣。4、成功构建5个菠萝叶刺形成相关基因的过表达载体,并转化模式植物拟南芥,均获得阳性植株,转 35S::AcBLH2、35S::AcLBD15、35S::AcSPL14和 35S::AcTBL19阳性植株叶形与野生型拟南芥均无明显差异,转35::AcKNOX1阳性拟南芥叶面皱缩,部分叶片叶裂加深,叶表皮毛密度明显增大,生长发育后期出现黄化现象。5、采用洋葱内表皮细胞进行亚细胞定位实验,结果表明AcKNOX1定位于细胞核中,推测其可能主要在细胞核中发挥转录因子的调控作用。6、分别在菠萝有叶刺、无叶刺叶边缘中成功获得AcKNOX1基因的启动子,测序结果显示两个启动子核酸序列一致,对其启动子分析发现具有赤霉素、细胞分裂素和脱落酸等多种激素的响应元件,可能调控激素合成途径(响应途径)中相关基因的表达,影响植物生长发育;该基因的启动子还具有光响应元件、厌氧诱导顺式调控元件和环境胁迫响应元件等调控元件,表明AcKNOX1基因可能还参与其它生物学途径。利用赤霉素、细胞分裂素和脱落酸三种激素对菠萝幼苗进行处理,荧光定量分析发现三种激素处理条件下,随着时间的推移,AcKNOX1在菠萝幼苗中的表达量呈现先上升后下降的趋势,且分别在8 h、12 h和12 h相对表达量达到峰值。表明这三种激素均能诱导AcKNOX1基因的表达。本研究从不同叶缘形态的菠萝叶中,成功分离获得7个与菠萝叶刺形成可能相关的基因,初步鉴定只有AcKNOX1基因可能在菠萝叶刺发生中起关键作用;在有叶刺、无叶刺菠萝叶中,AcKNOX1基因差

关键词：菠萝叶缘发育 AcKNOX1 亚细胞定位遗传转化启动子

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