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利用可诱导表达Cas9的HeLa细胞系进行顺铂耐药性基因筛选

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南京医科大学学报（自然科学版） 2021年第10期41卷 1432-1439,1452页

作者：陈红全王建瑛浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科浙江杭州310016 南京医科大学生殖医学国家重点实验室江苏南京211166

目的:利用PiggyBac转座子系统,构建可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系,并针对人核受体基因构建sg RNA文库,进行顺铂耐药性基因筛选。方法:构建PB-TRE-Cas9-NLS-IRES-hrGFP-Zeo载体,与PB-CAG-rtTA以及转座酶载体一同电转到HeLa细胞中,通过... 详细信息

目的:利用PiggyBac转座子系统,构建可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系,并针对人核受体基因构建sg RNA文库,进行顺铂耐药性基因筛选。方法:构建PB-TRE-Cas9-NLS-IRES-hrGFP-Zeo载体,与PB-CAG-rtTA以及转座酶载体一同电转到HeLa细胞中,通过药筛和挑选单克隆得到稳定细胞系;构建核受体基因sgRNA病毒文库,并感染可诱导表达Cas9的HeLa细胞系,筛选对顺铂具有抵抗性的克隆,并进行目的基因的测序鉴定。结果:挑选出可诱导表达Cas9的8E单克隆细胞株,在5个基因位点上可以进行高效编辑;感染sgRNA文库之后,挑选顺铂耐药的克隆,并鉴定出大部分克隆含有VDR sg RNA,经测序发现这些克隆中的VDR基因发生突变。结论:利用PiggyBac转座子系统,构建了可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系,利用这个细胞系可以在多位点进行高效基因编辑,并可用于高通量文库筛选顺铂耐药性基因。

关键词： CRISPR/Cas9 PiggyBac转座子可诱导表达文库筛选

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小鼠转基因的可诱导表达

国外医学（分子生物学分册） 2003年第1期25卷 47-50页

作者：刘仲荣李巍刘玉峰高天文第四军医大学西京医院全军皮肤性病中心西安710032

转基因小鼠是研究基因表达调控及表达产物生物学效应的最佳体系之一。小鼠转基因可诱导表达系统的研究和应用为实现对转基因表达在时间和空间上进行严格调控 ,深入研究单一基因在生物体不同发育阶段、不同生理条件和不同病理状态下不同... 详细信息

转基因小鼠是研究基因表达调控及表达产物生物学效应的最佳体系之一。小鼠转基因可诱导表达系统的研究和应用为实现对转基因表达在时间和空间上进行严格调控 ,深入研究单一基因在生物体不同发育阶段、不同生理条件和不同病理状态下不同组织中的功能作用提供了有力的手段。

关键词：小鼠转基因可诱导表达基因表达调控基因治疗

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植物可诱导基因表达系统的研究进展

分子植物育种 2022年第10期20卷 3266-3276页

作者：张壮张钱钱张萌萌董子健孙雯雯曹雪松胡全安聊城大学生命科学学院聊城252000

基因表达是植物分子生物学研究中的主要手段之一,在理论研究和农业应用研究中广泛应用。早期的研究因基础薄弱和工具欠缺,大多使用组成型启动子,如最常用的花椰菜花叶病毒35S启动子,介导基因过表达。随着研究的深入,人们对基因表达的分... 详细信息

基因表达是植物分子生物学研究中的主要手段之一,在理论研究和农业应用研究中广泛应用。早期的研究因基础薄弱和工具欠缺,大多使用组成型启动子,如最常用的花椰菜花叶病毒35S启动子,介导基因过表达。随着研究的深入,人们对基因表达的分子生物学有了更多的了解,进而衍生出一些较为成熟的工具。为了更精确地对基因表达的时间、空间和数量进行调控,已发展了多个植物可诱导基因表达系统。根据诱导物的不同,常见的表达系统有四环素诱导、类固醇诱导、乙醇诱导、杀虫剂诱导及铜诱导。这些系统因所使用的因子及组分不同,而各自有不同的工作原理;同时,他们也有明显的共性,即通常含有两个元件,激活元件和响应元件。本研究对上述植物可诱导表达系统的基本组成、工作原理及其特点进行了分析、评述和展望。

关键词：植物基因表达可诱导表达转录因子激活元件响应元件

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分枝杆菌同源可控表达系统的建立及其应用

中华微生物学和免疫学杂志 2009年第12期29卷 1104-1109页

作者：范小勇马辉郭建朱召芹郭盛淇赵国屏复旦大学附属上海市公共卫生临床中心 201508 上海生物制品研究所复旦大学生命科学学院微生物系上海200433

目的构建分枝杆菌可控表达载体，利用其过表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）的免疫保护性抗原，亲和层析纯化后分析免疫原性。方法应用PCR扩增耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，Ms）乙酰胺酶编码基因启动子（... 详细信息

目的构建分枝杆菌可控表达载体，利用其过表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）的免疫保护性抗原，亲和层析纯化后分析免疫原性。方法应用PCR扩增耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，Ms）乙酰胺酶编码基因启动子（pACE），构建分枝杆菌可控表达载体pMF系列；克隆Mtb嵌合抗原编码基因并用乙酰胺进行诱导表达，以Ni^2＋亲和层析纯化重组蛋白；并用该重组嵌合抗原Ag856 A2对卡介苗（BCG）免疫的小鼠脾细胞进行体外刺激，以IFN-γ酶联免疫斑点技术（ELISPOT）分析其免疫原性。结果成功构建了分枝杆菌可控表达载体pMF系列，利用0．02％乙酰胺进行诱导可实现目标抗原在Ms中的高水平表达；同时利用引入的6×Ilis标签可方便实现重组抗原的一步纯化，且该同源表达重组抗原可诱导更高水平IFN-γ的分泌。结论以Ms乙酰胺酶编码基因启动子pACE为基础构建的分枝杆菌可控表达系统可实现Mtb抗原在Ms中的高水平表达与纯化，与大肠杆菌异源表达相比，该同源表达重组抗原具有更好的免疫原性。

关键词：分枝杆菌乙酰胺酶启动子同源表达可诱导表达

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乙肝病毒X基因可调控表达细胞模型的构建

生物技术通报 2013年第2期29卷 140-145页

作者：白荷露刘蕊朱乃硕复旦大学生命科学学院微生物学与微生物工程系上海200433

利用四环素诱导型慢病毒系统(Lentil-XTMTet-On Advanced Inducible Expression System)构建了含有乙肝病毒X基因(HBx)的可诱导表达载体质粒,利用慢病毒包装细胞系HEK293T细胞分别获得含有调控元件rt-TA和HBx基因的病毒颗粒,滴度达到108... 详细信息

利用四环素诱导型慢病毒系统(Lentil-XTMTet-On Advanced Inducible Expression System)构建了含有乙肝病毒X基因(HBx)的可诱导表达载体质粒,利用慢病毒包装细胞系HEK293T细胞分别获得含有调控元件rt-TA和HBx基因的病毒颗粒,滴度达到108LPs/mL。将两种病毒先后感染HepG2肝癌细胞系,分别利用G418和Puromycin抗生素筛选获得整合有HBx基因的稳定细胞株。在体系中加入Dox时,应用RT-PCR和Western blot方法验证了HBx基因的可诱导表达。可诱导表达细胞模型构建成功,为进一步研究HBx基因在对宿主感染致病和免疫耐受中的作用提供了一种较理想的试验模型。

关键词：乙型肝炎病毒基因慢病毒表达载体四环素调控可诱导表达

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表达载脂蛋白L1稳定细胞系的构建

中国病原生物学杂志 2019年第4期14卷 401-405页

作者：曹观华曹广进刘舒宁程晓敏仇艺娴李凌朱利南方医科大学公共卫生学院三级生物安全实验室广东广州510515 南方医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室

目的利用Cumate系统实现APOL1基因在293T细胞内的可诱导稳定表达。方法通过查询NCBI数据库,设计APOL1基因编码区全长引物,克隆至Cumate慢病毒质粒。嘌呤霉素筛选包装慢病毒感染的293T细胞,阳性细胞扩大培养后用不同浓度的Cumate诱导表达... 详细信息

目的利用Cumate系统实现APOL1基因在293T细胞内的可诱导稳定表达。方法通过查询NCBI数据库,设计APOL1基因编码区全长引物,克隆至Cumate慢病毒质粒。嘌呤霉素筛选包装慢病毒感染的293T细胞,阳性细胞扩大培养后用不同浓度的Cumate诱导表达,利用Real-time PCR和Western blot验证APOL1的表达情况。结果构建的293T细胞系可被Cumate诱导表达APOL1,且不同浓度的Cumate对细胞表达载脂蛋白L1有不同的影响。Real-time PCR和Western blot均证明在诱导48 h后,随着诱导剂浓度的增加,APOL1表达增多,在Cumate为50μg/ml时APOL1达到最高值。结论成功构建了可诱导表达APOL1基因的293T细胞系,为研究APOL1在EV71感染人体细胞过程中的作用机制提供了稳定的实验材料。

关键词：可诱导表达载脂蛋白L1 慢病毒细胞系构建

载脂蛋白L1在肠道病毒A71复制中作用的初步研究

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载脂蛋白L1在肠道病毒A71复制中作用的初步研究

作者：曹观华南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景和意义载脂蛋白L1是人体内的固有免疫因子,仅在人类和少数哺乳动物体内表达。作为该蛋白家族中唯一可以分泌到血液中的成员,APOLl蛋白是高密度脂蛋白的组成成分,具有溶锥虫作用。2014年,Taylor等阐明细胞内APOL1蛋白具有抗感染... 详细信息

研究背景和意义载脂蛋白L1是人体内的固有免疫因子,仅在人类和少数哺乳动物体内表达。作为该蛋白家族中唯一可以分泌到血液中的成员,APOLl蛋白是高密度脂蛋白的组成成分,具有溶锥虫作用。2014年,Taylor等阐明细胞内APOL1蛋白具有抗感染作用。细胞内APOLl蛋白可以抑制HIV-1在巨噬细胞内的复制。本课题组前期研究发现,在EV-A71感染引起的手足口病重症患儿血液中APOLl蛋白过高表达。因此本研究通过构建Apol1基因敲除细胞株和过表达细胞株来探究APOLl蛋白对EV-A71在细胞内复制中的作用,不仅有助于理解EV-A71的致病机制,而且可以为EV-A71的重症感染的防治提供新的思路和途径。研究方法(1)针对Apol1基因设计siRNA,敲减HBMEC细胞中APOL1蛋白表达并检测细胞中EV-A71的复制情况。(2)利用CRISPR/Cas9技术构建敲除Apol 1基因的HBMEC稳定细胞株(3)利用Cumate表达载体构建可诱导稳定表达APOLl的293T细胞株(4)EV-A71分别感染以上构建的两种细胞株,探索APOL1与EV-A71复制的关系结果(1)在HBMEC中,转染Apol1 siRNA并感染EV-A71 24h后,细胞内病毒含量相对于未敲减的细胞显著提高(F=170.4,p可诱导表达APOLl蛋白的293T细胞,命名为293T-APOLl-GFP,同时感染空载的细胞命名为293T-GFP。经rea1-time PCR和western blot验证,293T-APOL1-GFP细胞表达APOL1的量随着诱导剂浓度的增加而增加,且到50μg/ml和100μg/ml时,APOL1蛋白表达量达到最大(F=537.9,p诱导剂浓度低于200μg/ml时,细胞生长无影响(F=1.082,p=0.2903)。(4)病毒分别感染HBMEC-APOL1-KO和293T-APOL1-GFP细胞株,出现同样的结果,病毒感染12h,细胞内病毒含量比对照组明显提高(F=196.2,p表达的APOL1可抑制EV-A71的复制;在无APOL1表达HBMEC中,EV-A71的复制增加;在过表达APOL1的293T中,EV-A71的复制也增加。综上所述,本研究初步确定了在EV-A71的复制过程中,APOL1发挥了一定的作用

关键词：载脂蛋白L1 肠道病毒A71型基因敲除可诱导表达

慢病毒系统HBV基因可调控表达动物模型的构建

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慢病毒系统HBV基因可调控表达动物模型的构建

作者：孙勇复旦大学

学位级别：硕士

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种在世界范围内严重危害人类健康的疾病。目前,全世界大约有3.5亿人感染乙肝病毒,我国约有0.3亿人患有乙型肝炎,有很大一部分患者并发肝硬化及原发性肝癌。我国是乙肝高流行区,每年新发病例... 详细信息

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种在世界范围内严重危害人类健康的疾病。目前,全世界大约有3.5亿人感染乙肝病毒,我国约有0.3亿人患有乙型肝炎,有很大一部分患者并发肝硬化及原发性肝癌。我国是乙肝高流行区,每年新发病例约200万,造成的经济损失高达近万亿元。乙型肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒,仅感染灵长类动物及少数其它物种。经过近半个世纪的研究,乙型肝炎至今仍然没有被攻克,其原因主要是免疫耐受会造成HBV感染的慢性化,同时免疫耐受也是HBV持续感染的重要因素。因此,深入了解乙肝病毒免疫耐受的形成机制、弄清维持免疫耐受的分子基础及其特征,这是目前攻克乙型病毒性肝炎的重要研究方向。研究乙肝病毒免疫耐受形成机制、弄清维持耐受的细胞学特征和分子机制需要打破动物模型造成的瓶颈。但迄今为止,可以用来研究乙型肝炎病毒的动物模型主要有黑猩猩、小鼠、土拨鼠、鸭等动物,它们由于自身局限性及稳定性而不适合作为常规的实验动物模型;更为重要的是：上述动物模型中乙型肝炎病毒DNA在建模初期就已稳定的整合到动物肝细胞的基因组,形成了病毒与宿主细胞静态相容的结果,因此不能反映病毒侵染过程中细胞内动念变化的过程,更无法达到对免疫耐受形成前后的差异性研究。因此我们选用四环素调控的慢病毒系统来构建乙肝动物模型并实现乙肝病毒基因在动物体内的可调控表达,通过人为的控制来研究不同发育时期及不同免疫状态下动物体内的整体变化情况,以此来对形成免疫耐受前后的体内状态进行研究,预期找出免疫系统的差异性如特异性的分子或者靶点的差异,找到打破免疫耐受的突破口。这对于揭示乙肝病毒特异免疫耐受的形成机制、弄清维持耐受的细胞和分子基础及特征,将会产生深远的影响。在实验室之前的工作中,已经构建了含有乙肝病毒各个基因(X,P,C,preC-C, S,preS2-S,PreS1-S2-S)的可诱导表达载体质粒系统,本研究中将载体利用慢病毒包装细胞系HEK 293T细胞分别获得含有调控质粒pLVX-Tet-On和表达质粒pLVX-X及pLVX-LS的病毒颗粒,获得的病毒滴度达到可108LPs/mL。将包装获得的病毒等量混合后进行小鼠睾丸注射,每只雄性小鼠的左右侧睾丸内各注射约10μL的病毒,注射后与母鼠合笼,母鼠经过怀孕、分娩生产获得子代FO代小鼠。提取F0代小鼠的基因组,通过southern-blot和反向PCR的方法对子代小鼠基因组内目的基因的整合情况进行研究分析。经过鉴定后对其中含有四环素调控基因及乙肝病毒部分基因的小鼠进行诱导蛋白质的表达。诱导72h后提取其肝脏组织的蛋白质进行western-blot验证及其对其肝脏组织、肾脏组织进行免疫组织化学分析。检测目的基因的蛋白表达情况。结果：本实验共获得F0代小鼠共96只,通过Southern-blot和反向PCR的方法对F0代小鼠基因组的分析,在所获得的F0代小鼠中,四环素调控基因阳性小鼠共14只,阳性率为14.58%,乙肝病毒X组小鼠49只,阳性小鼠5只,阳性率为10.20%。将经过鉴定后的小鼠进行诱导,在小鼠饮水中加以浓度为1.5mg/mL的强力霉素(DOX)进行诱导乙肝病毒-X基因的蛋白表达,诱导72h后提取小鼠的肝脏组织及其肝脏组织内总蛋白,进行western-blot分析及免疫组织化学分析。结果表明：小鼠体内发现其乙肝病毒-X基因的蛋白表达。经过对小鼠的肝脏组织及肾脏组织的免疫组织化学分析,结果同样表明小鼠体内组织内存在乙肝病毒的X蛋白。

关键词：乙型肝炎病毒慢病毒表达系统动物模型可诱导表达

慢病毒系统HBV基因可调控表达细胞模型的构建

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慢病毒系统HBV基因可调控表达细胞模型的构建

作者：白荷露复旦大学

学位级别：硕士

乙型病毒性肝炎(hepatitis B, HB)是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的世界范围内流行的一种严重危害人类健康的疾病。HBV感染后,有相当部分的患者最终将转化为慢性肝病,并发肝硬化和原发性肝癌。以往用于HBV研究的实验模型多为HepG2细胞,HCC... 详细信息

乙型病毒性肝炎(hepatitis B, HB)是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的世界范围内流行的一种严重危害人类健康的疾病。HBV感染后,有相当部分的患者最终将转化为慢性肝病,并发肝硬化和原发性肝癌。以往用于HBV研究的实验模型多为HepG2细胞,HCC组织及转基因动物等模型,这些模型中HBV DNA均已稳定的整合入肝细胞的基因组,是一种与宿主细胞静态相容的结果,不能反映病毒感染过程中细胞中动态变化过程,以作为观察研究病毒抗原与宿主互作的研究模型。为此我们选用四环素调控的慢病毒系统来实现乙肝病毒基因的可调控表达,通过人为的控制可观察不同时期细胞内的整体变化情况。研究中,我们构建了含有乙肝病毒基因(X, P, C, preC-C, S, preS2-S, PreS1-S2-S)的七种可诱导表达载体质粒,经鉴定DNA序列正确。利用慢病毒包装细胞系HEK293T细胞分别获得含有调控质粒pLVX-Tet-On和表达质粒pLVX-GOI的病毒颗粒,滴度达到可108LPs/ml。将这两种病毒共感染HepG2和L02细胞株,并利用双重抗生素筛选(G418和Puromycin)获得整合有目的基因的稳定细胞株。随后,对于构建的细胞株中目的基因的存在进行了鉴定,并对其中含有X和PreS1-S2-S的细胞株HepG2-X/LS诱导表达的RNA进行鉴定,证明获得可诱导表达的mRNA,进一步对X转基因细胞HepG2-X进行诱导产物X蛋白鉴定,证明获得了X蛋白可诱导表达的细胞株。HBV基因可调控细胞模型的构建,为进一步研究HBV各基因在对宿主感染致病和免疫耐受中的作用提供了理想的实验模型。

关键词：乙型肝炎病毒慢病毒表达系统四环素调控可诱导表达