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生理学报 2013年第2期65卷 143-148页

作者：张文成卢元明杨怀章徐彭涛常惠余志斌第四军医大学航空航天医学教育部重点实验室航空航天生理教研室西安710032 空军西安飞行学院门诊部西安710306

失重或模拟失重引起体液的头向转移,导致上半身血容量增加,从而引起心房肌心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,AnP)分泌的改变,但现有研究报道缺乏一致的结论。本研究拟观测模拟失重大鼠心肌AnP表达的变化,并以可溶性n-乙基马来酰... 详细信息

失重或模拟失重引起体液的头向转移,导致上半身血容量增加,从而引起心房肌心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,AnP)分泌的改变,但现有研究报道缺乏一致的结论。本研究拟观测模拟失重大鼠心肌AnP表达的变化,并以可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(soluble n-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors,SnARE)家族相关蛋白的变化作为AnP变化的佐证。采用公认的尾部悬吊大鼠模型在地面模拟失重状态,蛋白印迹法检测心房与心室肌AnP与SnARE相关蛋白的表达水平,并进行半定量分析。结果显示,与同步对照组(COn)相比,尾部悬吊4周大鼠(SUS)心房肌AnP表达增加;在COn大鼠左心室肌仅显示微量AnP表达,但SUS大鼠心室肌AnP表达明显增加。相比COn组,SUS组囊泡SnARE(v-SnARE)VAMP-1/2在心房肌与心室肌表达明显增加;细胞膜靶标SnARE(t-SnARE)syntaxin-4的表达未改变,但SnAP-23在心房肌的表达明显增加。SnARE调节蛋白synip与Munc-18c的表达在心房肌与心室肌未发生显著性改变。上述结果表明,尾部悬吊4周引起心房肌AnP表达增加,心室肌呈现AnP表达;与AnP囊泡相关的VAMP-1/2的表达亦增加,佐证心房肌与心室肌AnP表达增加。

关键词：尾部悬吊模型大鼠心房利钠肽可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体

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SnARE／Munc18b复合体介导脓毒症血小板α颗粒释放及CORM-2的干预机制

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中华危重病急救医学 2017年第2期29卷 156-161页

作者：庄明峰孙炳伟刘大东石源江阴市人民医院重症医学科江苏江阴214400 江苏大学附属医院烧伤整形科江苏镇江212000 江苏大学附属医院重症医学科江苏镇江212000

目的探讨可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体及其调节因子突触融合蛋白结合蛋白b（SnARE/Munc18b）复合体介导的脓毒症血小板α颗粒释放及一氧化碳释放分子Ⅱ（CORM-2）的干预机制。方法采集健康成人肘静脉血，差速离心法分离... 详细信息

目的探讨可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体及其调节因子突触融合蛋白结合蛋白b（SnARE/Munc18b）复合体介导的脓毒症血小板α颗粒释放及一氧化碳释放分子Ⅱ（CORM-2）的干预机制。方法采集健康成人肘静脉血，差速离心法分离出富含血小板血浆（PRP），并随机分为对照组、脂多糖（LPS）组（10 mg/L）、LPS＋iCORM-2组（10 mg/L LPS ＋ 50 μmol/L无活性CORM-2），LPS＋L-CORM-2组（10 mg/L LPS ＋ 10 μmol/L CORM-2）、LPS ＋ H-CORM-2组（10 mg/L LPS ＋ 50 μmol/L CORM-2）。各组于37？℃、湿度95%、5% CO2培养箱孵育30 min取上清液，用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血小板α颗粒释放物质血小板因子4（PF4）、血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）和基质金属蛋白酶2（MMP-2）含量；流式细胞仪检测血小板P-选择素的表达；透射电镜和激光共聚焦显微镜下观察血小板α颗粒的分布；蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测血小板关键膜融合分子Munc18b及相关SnARE蛋白囊泡相关膜蛋白-8（VAMP-8）、突出相关蛋白-23（SnAP-23）、突出融合蛋白-11（STX-11）的表达；免疫沉淀法检测SnARE/Munc18b复合体的形成。结果与对照组比较，LPS组血小板α颗粒释放PF4、PDGF-BB、MMP-2、P-选择素的量明显升高；而低、高浓度CORM-2能有效抑制LPS刺激后血小板α颗粒的释放〔PF4（μg/L）：7.69±0.58、6.03±0.71比10.13±0.82，PDGF-BB（μg/L）：112.71±1.79、102.91±5.86比128.78±1.39，MMP-2（ng/L）：32.94±2.73、27.58±3.36比53.26±1.21，P-选择素：（17.14±0.57）%、（15.35±0.68）%比（23.78±0.62）%，均P〈0.01〕，且呈剂量依赖趋势。透射电镜和激光共聚焦显微镜下观察，CORM-2能减少LPS刺激后血小板α颗粒向血小板膜周围分布，并可抑制与包膜融合。与对照组比较，LPS刺激后血小板Munc18b和相关SnARE蛋白表达，以及SnARE/Munc18b复合体形成均显著增加；而低、高浓度CORM-2能有效抑制LPS刺激后血小板Munc18b和SnARE蛋白表达以及SnARE/Munc18b复合体形成（Munc18b/GAPDH：0.80±0.08、0.69±0.01比0.99±0.09，VAMP-8/GAPDH：0.72±0.09、0.50±0.12比1.18±0.14，SnAP-23/GAPDH：1.18±0.22、0.63±0.10比1.90±0.08，STX-11/GAPDH：0.76±0.02、0.57±0.08比1.16±0.23，VAMP-8/Munc18b：0.65±0.09、0.53±0.07比1.21±0.20，SnAP-23/Munc18b：0.85±0.07、0.55±0.09比1.26±0.08，STX-11/Munc18b：0.78±0.05、0.61±0.10比1.39±0.16，均P〈0.01），且呈剂量依赖趋势。iCORM-2则无此作用。结论CORM-2干预能够有效抑制脓毒症时血小板α颗粒的异常释放，并呈剂量依赖趋势，其作用机制可能涉及SnARE/Munc18b复合体的形成。

关键词：脓毒症血小板α颗粒可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体突触融合蛋白结合蛋白b 一氧化碳释放分子Ⅱ

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脊髓背角SnARE复合物在慢性炎性疼痛中的作用

脊髓背角SNARE复合物在慢性炎性疼痛中的作用

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作者：段兴连兰州大学

学位级别：硕士

目的:可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(Soluble n-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors,SnARE)介导的膜融合在囊泡运输及神经递质释放中发挥重要作用。最近的研究证实,包括n-甲基-D-天冬氨酸(n-m... 详细信息

目的:可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(Soluble n-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors,SnARE)介导的膜融合在囊泡运输及神经递质释放中发挥重要作用。最近的研究证实,包括n-甲基-D-天冬氨酸(n-methyl-D-aspartate,nMDA)型谷氨酸受体在内的突触后受体的膜运输,也依赖于SnARE蛋白介导的胞吐作用(Exocytosis)。现已知,nMDA受体在痛觉敏化中发挥关键作用,SnARE复合物也参与突触可塑性。然而,脊髓背角浅层神经元中SnARE复合物确切的组成形式及其功能尚不明确。本研究将探讨脊髓背角SnARE复合物的主要组成及其在慢性炎性疼痛中的可能作用。方法:采用免疫荧光组织化学法观察脊髓背角SnAP25的分布;利用免疫共沉淀、免疫印迹法调查大鼠脊髓背角SnARE蛋白家族之间的相互作用;大鼠足底皮下注射完全弗氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)建立慢性炎性疼痛模型,通过鞘内注射可干扰SnARE复合物形成的多肽pep-SnAP25,探究外周炎症对脊髓背角SnARE核心复合物组装的调控作用;利用免疫共沉淀、免疫印迹、膜蛋白生物素标记法、行为学等方法,探究脊髓背角SnARE复合物参与痛觉调控的分子机制。结果:(1)免疫组织化学结果显示,SnAP25大量分布在脊髓灰质浅层的背角神经元中,并且与突触后标记物PSD95(postsynaptic density protein of 95 kDa)呈共分布,而其同源蛋白SnAP23主要分布在脊髓白质周围的神经纤维束中;(2)用抗SnAP25特异性抗体可从大鼠脊髓背角裂解液中免疫共沉淀出syntaxin1、syntaxin2、syntaxin3、syntaxin4、VAMP1、VAMP2、Munc18-1、Munc18-2和Munc18-3,但所沉淀出的syntaxin4、VAMP2和Munc18-1的相对含量远远高于它们的同源物;(3)用抗syntaxin4特异性抗体也可从大鼠脊髓背角裂解液中免疫共沉淀出SnAP25、VAMP2和Munc18-1,提示:在脊髓背角,SnAP25、syntaxin4、VAMP2和Munc18-1可主导性组成SnARE核心复合物;(4)足底皮下注射CFA可显著增加SnAP25免疫共沉淀物中syntaxin4、VAMP2和Munc18-1的相对含量;(5)足底皮下注射CFA也可显著增加syntaxin4免疫共沉淀物中SnAP25、VAMP2和Munc18-1的相对含量,提示:外周炎症可促进脊髓背角SnAP25/syntaxin4/VAMP2/Munc18-1核心复合物的组装;(6)鞘内给予γ-氨基丁酸A型受体(γ-aminobutyric acid type A receptor,GABA受体)拮抗剂bicuculline(0.5μg)或nMDA受体激动剂nMDA(1.0μg),可显著提升SnAP25免疫共沉淀物中syntaxin4、VAMP2和Munc18-1的相对含量;(7)鞘内给予nMDA受体拮抗剂D-APV(1.0μg),可显著抑制bicuculline增强SnAP25与syntaxin4、VAMP2、Munc18-1相互作用的效应,表明:脊髓背角SnARE复合物的组装受到神经活动及nMDA受体活性的密切调控;(8)鞘内注射能干扰SnARE蛋白间相互作用的多肽pep-SnAP25,可显著抑制炎性大鼠包含Glun2B亚基的nMDA受体(Glun2B subunit-containing nMDA receptors,Glun2BRs)的膜表达和突触表达,提示:SnARE复合物在Glun2B受体的胞吐作用中发挥重要作用;(9)鞘内注射pep-SnAP25能剂量依赖性地抑制CFA所引发的机械性缩足阈值(paw withdrawal thresholds,PWTs)和热缩足潜伏期(paw withdrawal latencies,PWLs)的降低,提示:干扰SnAP25/syntaxin4/VAMP2/Munc18-1复合物可有效抑制慢性炎性疼痛。结论:在脊髓背角神经元中,SnAP25、syntaxin4、VAMP2和Munc18-1可主导性组成SnARE复合物。外周炎症可促进此复合物的组装,进而调控nMDA受体的胞吐作用,提高突触表达。干扰此复合物的形成可缓解外周炎症诱发的机械性痛觉超敏与热痛觉过敏。

关键词：可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体 n-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受体炎性疼痛脊髓背角

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选择性抑制外周痛觉神经元兴奋的慢病毒载体的构建及其功能的研究

选择性抑制外周痛觉神经元兴奋的慢病毒载体的构建及其功能的研究

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作者：王婉至河南大学

学位级别：硕士

慢性疼痛严重危害人们健康,影响着20%以上的世界人口。传统的止痛药物和抗炎药物都是短效的,通常伴有严重的毒副作用。因此,寻找安全有效治疗措施是当今医学界亟待攻克的难题。可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(Soluble n-et... 详细信息

慢性疼痛严重危害人们健康,影响着20%以上的世界人口。传统的止痛药物和抗炎药物都是短效的,通常伴有严重的毒副作用。因此,寻找安全有效治疗措施是当今医学界亟待攻克的难题。可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(Soluble n-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor,SnARE)介导的神经肽分泌以及痛觉受体和离子通道的异常表达与慢性疼痛的发生发展密切相关,但仍然缺乏安全有效干预手段。因此在外周感觉神经元中选择性表达可灭活SnARE的A型肉毒素蛋白酶基因(LCA)可作为基因治疗慢性疼痛的新途径。然而,这种方法的安全问题是寻找在感觉神经元中特异表达蛋白酶的启动子,杜绝在非靶向组织中的表达,避免不必要的副作用。为此,我们利用磷脂酰肌醇互作的瞬时受体电位通道的调节蛋白(Phosphoinositide-interacting regulator of transient receptor potential channels,PIRT)主要在背根(Dorsal root ganglion,DRG)和三叉神经节(Trigeminal ganglion,TG)神经元的外周神经(并非中枢)系统中表达的独特特性,通过Ensembl工具分析了PIRT基因,首次将其启动子元件(PIRTPro)克隆到慢病毒载体中,在其下游插入LCA基因,构建了含新型表达单元PIRTPro-LCA的慢病毒载体。由于RFT-I启动子已报道能优先在初级感觉神经系统表达,我们因此也构建了RFT-IPro-LCA表达单元,并将其克隆到慢病毒载体中。将慢病毒载体与p SPAX2和p MD2G共转染包装宿主293T细胞,制备了高滴度的慢病毒。通过病毒体外感染细胞实验发现,与预期一致,PIRT启动子能在外周感觉神经元中特异性表达外源基因,而不能在脊髓组织细胞和非神经细胞(小鼠免疫细胞和人角质形成细胞)中表达,从而证实了PIRT启动子的组织特异性。RFT-IPro-LCA和PIRTPro-LCA病毒均可在体外培养的DRG和TGn神经元中表达LCA基因,浓度依赖性切割SnAP-25蛋白。PIRTPro-LCA可显著抑制痛觉神经元激活后过度分泌的P物质(Substance P,SP),且作用具有长效性。巨噬细胞分泌的炎性因子能显著上调神经细胞中离子通道的表达,相较于对照GFP病毒感染的神经细胞来说,PIRTPro-LCA切割SnAP-25可显著抑制TRPV1、TRPA1和na1.7等痛觉相关离子通道蛋白的表达,同时还可以降低痛觉神经递质P物质和降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)的转录及下调神经肽Y Y2受体、5-羟色胺3A受体和G蛋白偶联受体52等基因m RnA的表达。由于神经多肽(P物质和CGRP),痛觉受体和离子通道蛋白在疼痛的发生和传导中起重要作用,因此构建的慢病毒对它们的表达和/或释放的抑制效果,显示了有基因治疗慢性疼痛的潜力。综上所述,我们首次克隆了Pirt启动子并验证了其外周感觉神经元组织特异性,为在体内研究特定基因在感觉神经元中的生物活性提供了新的手段。利用PIRTPro表达LCA外源基因来抑制痛觉发生和信号传导,为感觉神经回路的研究奠定了基础,也为治疗慢性疼痛研发了新的方法,具有潜在的社会和经济效益。

关键词：慢性疼痛基因治疗慢病毒载体可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体

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囊泡膜核苷酸转运体在核苷酸囊泡转运机制的研究进展

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黑龙江医学 2017年第3期41卷 286-287页

作者：陈立强王洋洋司艳辉梁洁玲李海珠肇庆市第一人民医院广东肇庆526060

核苷酸在细胞内的运输不能自由穿过细胞膜,其储存与运输必须以囊泡运输的方式进行跨膜转运,当囊泡与胞膜融合时将核苷酸等内容物质释放到细胞外[1]。要探讨细胞外核苷酸/核苷激发的信号通路,就必须要理解三磷酸腺苷（ATP）和其他核酸是... 详细信息

核苷酸在细胞内的运输不能自由穿过细胞膜,其储存与运输必须以囊泡运输的方式进行跨膜转运,当囊泡与胞膜融合时将核苷酸等内容物质释放到细胞外[1]。要探讨细胞外核苷酸/核苷激发的信号通路,就必须要理解三磷酸腺苷（ATP）和其他核酸是如何从细胞内释放出来的,而这也是生理学上的一个重要问题[2];自从囊泡膜核苷酸转运体（vesicular nucleotide transporter,VnUT）被发现,其就作为ATP转运的关键因子而被广泛关注[3];

关键词：囊泡膜核苷酸转运体三磷酸腺苷 SLC17A9 可溶性n-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体

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