检索结果-南通市图书馆

作者：刘辉华中师范大学

学位级别：硕士

真核基因表达调控是生命科学研究的前沿、热点。RNA的选择性剪接在真核基因表达调控中起着十分重要的作用。真核细胞mRNA前体经过剪接成为成熟的mRNA,而mRNA前体的选择性剪接极大地增加了蛋白质的多样性和基因表达的复杂程度。而内含子... 详细信息

真核基因表达调控是生命科学研究的前沿、热点。RNA的选择性剪接在真核基因表达调控中起着十分重要的作用。真核细胞mRNA前体经过剪接成为成熟的mRNA,而mRNA前体的选择性剪接极大地增加了蛋白质的多样性和基因表达的复杂程度。而内含子内部的组成结构对可变性剪接具有重要的影响。虽然这些作用机制还不是很清楚,但从生物进化的观点看来,这部分序列必定具有重要的生物功能。因此,分析基因内部内含子的组成结构,对进一步了解基因功能和表达的分子机制具有十分重要的意义。秀丽隐杆线虫(Caeborhabditis elegans)是重要的模式生物之一。tra-1基因是其性别决定中最重要的基因之一。在秀丽隐杆线虫性别决定信号通路中tra-1基因处于一系列基因调控的终端,因此它在性别控制中具有决定性的作用。tra-1基因编码锌指蛋白,在第二和第三锌指间的内含子处发生可变性剪接,并使该基因具有两个mRNA产物:一个1.5kb转录产物编码两锌指蛋白;另一个5kb转录产物编码五锌指蛋白。tra-1基因通过可变剪接加工来改变mRNA的3’末端,进而改变产物蛋白不同的活性。本文在tra-1基因的第一和第五锌指处分别设计上下游引物,通过对线虫基因组PCR得到约3.3kb片段,然后连接到T载体pBS-T上并转化大肠肝菌TG1,待大量扩增后,经PCR检测得到3.3kb片段,证实质粒重组构建成功,经测序证实克隆序列为tra-1基因五个锌指部分。通过比较测得序列和其mRNA序列发现1.5kb转录产物3’末端停在内含子的polyA处,而该内含子二级结构进一步表明该polyA位于二级结构的活性部位,而5’剪接信号GU则随内含子结构的变化而处于不同位置,因此可能使tra-1基因产生可变性剪接。综上所述,本项研究的创新之处在于首次通过秀丽隐杆线虫基因组用PCR方法克隆tra-1基因的锌指部分序列,不仅发现其内含子序列的组成结构对其可变性剪接有重要的影响,而且本研究结果将对克隆昆虫病原等索科线虫的相关性别决定基因提供参考价值和比较基础。

关键词：秀丽隐杆线虫内含子可变性剪接性别决定

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蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)全长转录组测序及分析

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生物技术通报 2021年第8期37卷 131-140页

作者：尚骁尧周玲芳尹芊芊晁跃辉北京林业大学草业与草原学院北京100083

为了深入分析和探索豆科模式植物蒺藜苜蓿的mRNA完整结构,使用单分子长读数测序技术(single-molecule long-read sequencing technology,SMRT)对蒺藜苜蓿进行全长转录组测序及分析。共获得7 728 183个subread和509 014条全长非嵌合序列(... 详细信息

为了深入分析和探索豆科模式植物蒺藜苜蓿的mRNA完整结构,使用单分子长读数测序技术(single-molecule long-read sequencing technology,SMRT)对蒺藜苜蓿进行全长转录组测序及分析。共获得7 728 183个subread和509 014条全长非嵌合序列(full-length non-chimeric read,FLNC),通过比对分析发现,94.36%的序列与93.01%的序列分别与蒺藜苜蓿R108与A17参考基因组匹配。总计存在8 406种可变性剪接,其中主要的剪接方式为内含子保留(intron retention,RI)。共发现23 926个基因,其中12 049个基因存在295 545条转录本,在这些转录本中至少存在一个poly(A)位点。此外,共鉴定出3 223条转录因子,6 595条长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和479条融合转录本。使用SMRT技术能够深入发掘蒺藜苜蓿转录数据,也为更好地利用蒺藜苜蓿基因组资源提供数据补充。

关键词：蒺藜苜蓿单分子全长读数测序可变性剪接融合转录本

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西葫芦cDNA全长转录组序列分析

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分子植物育种 2023年第24期21卷 8028-8035页

作者：张中海王美丽唐忠丽薛诗怡张安世雷逢进许小勇焦作师范高等专科学校焦作454002 山西农业大学园艺学院山西省设施蔬菜协同创新中心太谷030801 山西农业大学棉花研究所运城044000 海南省崖州湾种子实验室三亚572025

为解析西葫芦中类胡萝卜素积累的分子机制,本研究利用PacBio单分子长读长测序技术(single-molecule long-read sequencing technology,SMRT)对富含类胡萝卜素的黄皮西葫芦(21pu05)叶、雌花、雄花、未授粉果实和授粉10 d果实等组织的混... 详细信息

为解析西葫芦中类胡萝卜素积累的分子机制,本研究利用PacBio单分子长读长测序技术(single-molecule long-read sequencing technology,SMRT)对富含类胡萝卜素的黄皮西葫芦(21pu05)叶、雌花、雄花、未授粉果实和授粉10 d果实等组织的混合样品进行全长转录组测序分析。试验结果共获得循环一致序列(circular consensus read,CCS) 158 968条,其中全长非嵌合(full length reads non-chimeric,FLNC)序列113 284条。聚类分析获得高质量的一致序列28 383条,其中融合转录本有213个。进一步分析发现16 895个可变剪接基因位点,其中新基因位点1 734个,新转录本18 510个。序列结构预测鉴定出8 773个SSR位点、8 527个完整ORF序列,以及317个长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)。对16 508个新转录本进行了功能注释。以上研究结果为开展西葫芦类胡萝卜素合成相关基因的克隆及分子机制的解析提供参考。

关键词：黄皮西葫芦全长转录组可变性剪接融合转录本

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家蚕姬过剩肢（E）的定位克隆与候选基因的表达及进化分析

家蚕姬过剩肢（E）的定位克隆与候选基因的表达及进化分析

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作者：李丹丹西南大学

学位级别：硕士

家蚕(Bombyx mori)经过长期的驯化选择,成为重要的农业经济昆虫。家蚕适中的身型、较短的生长周期、较高的繁殖率以及良好的研究基础等优势,使之成为鳞翅目昆虫重要的模式生物。随着家蚕基因组框架图、精细图和重要遗传资源重测序的相... 详细信息

家蚕(Bombyx mori)经过长期的驯化选择,成为重要的农业经济昆虫。家蚕适中的身型、较短的生长周期、较高的繁殖率以及良好的研究基础等优势,使之成为鳞翅目昆虫重要的模式生物。随着家蚕基因组框架图、精细图和重要遗传资源重测序的相继完成,家蚕在分子生物学研究中的地位得到进一步提升。家蚕具有丰富的突变基因资源,涉及生长、变态、形态等各方面的重要遗传性状,是研究昆虫发育调控机制的重要材料。昆虫躯体模式(Body plan)与其生存和繁衍有着密切关系,研究其发育调控机制具有重要意义。在家蚕的突变资源中,躯体模式发育相关的突变体占据着较大的比例。对家蚕躯体模式突变的研究不仅能够深入理解鳞翅目昆虫形态发育的相关基因及调控途径,了解Hox基因作用于昆虫躯体模式发育的重要调控网络,还为利用昆虫功能基因的研究奠定坚实的基础。本研究中,我们选择家蚕典型的躯体模式突变体E群的代表突变——姬过剩肢(E)作为研究对象,利用定位克隆技术鉴定其候选基因,进而联系表型对候选基因进行相关研究。主要结果如下： 1.家蚕姬过剩肢突变(E)的表型观察利用体视显微镜和数码相机分别对家蚕野生型Dazao和姬过剩肢突变体E的胚胎发育后期(点青期)和5龄第3天幼虫进行表型观察。通过观察显示,在家蚕野生型Dazao胚胎发育后期,腹肢发育基本完成,即在第3-6腹节(A3-A6)上形成形态结构完整的腹足。而对突变体E的观察结果显示,E突变体除了在第3-6腹节上正常发育形成的4对腹肢之外,还在第2腹节发育出形态较小的1对过剩腹肢。在5龄第3天的幼虫时期,E突变型的过剩腹肢仍然存在,且其形态与正常腹肢不同,形似正常腹肢的远端部分。我们对过剩腹肢和正常腹肢的表型放大观察,发现过剩腹肢的爪钩数量远远少于正常腹肢,且其爪钩长度较短,在腹肢顶端排列成环状。而在Dazao中,爪钩密集排列成带状。除此之外,野生型Dazao幼虫在第2胸节背面有眼状纹,在第2、5腹节背面分别有1对半月纹和星状纹,而E突变型幼虫全身呈现素白,无任何斑纹。 2.姬过剩肢突变(E)的初定位分析姬过剩肢突变(E)位于家蚕经典连锁图谱第6连锁群的21.1cM处。利用家蚕第6连锁群的SSR分子标记以及在预测区域发展的新标记,对E的突变位点在300个个体的定位群体中进行初定位分析。通过对多态性分子标记的引物在定位群体各个体基因组中的PCR扩增产物进行电泳,再对电泳条带进行统计和分析,并将统计结果用作图软件对突变标记和各个分子标记进行连锁图谱的绘制,将突变候选区域的范围缩小到标记E3和E6之间,其距离为1.0cM。根据分子连锁图中突变基因所在位点,结合生物信息学分析在候选区域内筛查可能的候选基因。我们在该区域找到5个预测基因,它们分别为BGIBMGA006384, BGIBMGA006385, BGIBMGA006386, BGIBMGA006387, BGIBMGA006388。 3.姬过剩肢突变(E)的精细定位及候选基因的筛查根据对E突变初定位的结果,在候选区域内继续设计和筛选新的多态标记,并将定位群体扩大到1115个个体。利用新的多态标记精细定位,将候选区域进一步缩小在E33和E39之间,其物理距离大约为209kb,该区域中存在3个预测基因：BGIBMGA006386, BGIBMGA006387, BGIBMGA006388。其中,E32在1115个定位个体中没有发现交换个体,表明E32与E突变位点紧密连锁,由此判断候选基因位于标记E32附近。经信息分析和候选区域的序列比对,最终将候选基因确定为家蚕Bm-AbdA基因。 4.姬过剩肢突变体(E)候选基因多种剪接体的克隆对候选基因Bm-AbdA在家蚕野生型Dazao和E突变中进行多种剪接体的克隆,并对各种剪接体的序列比对分析。结果显示,在Dazao中Bmabd-A基因存在3种剪接形式,而在E突变中存在多达5种剪接形式,即在E突变中Bmabd-A基因除存在正常的3种剪接形式外,还有其独有的2种剪接形式。对各种剪接体进一步分析发现,所有的剪接体序列差异均发生在该基因的第2外显子上,其中,在E突变中发现一种新的剪接形式,其整个第2外显子完全缺失。 5.姬过剩肢突变(E)候选基因及其下游靶基因的表达检测为了分析多种不同的剪接方式与E突变的关系,我们对野生型Dazao和E突变型中Bm-AbdA基因进行mRNA及蛋白水平的定量检测。结果显示,在E突变中,Bm-AbdA基因无论在mRNA水平还是蛋白水平的表达量上都高于野生型Dazao,表达量约为Dazao中的2倍。为了研究Bm-AbdA基因表达量的上调对其下游靶基因的影响,我们对Bm-AbdA基因的直接下游靶基因Dll的表达量进行检验,发现Dll基因也存在表达上调的现象,且上调倍数与Bm-AbdA保持一致。 ***-A基

关键词：家蚕姬过剩肢突变(E) 定位克隆 Abd-A基因可变性剪接

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小胶质细胞核-质RNA在出血性脑卒中后神经炎症中的作用

小胶质细胞核-质RNA在出血性脑卒中后神经炎症中的作用

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作者：廖玉嫣西南医科大学

学位级别：硕士

出血性脑卒中是常见的危急重症之一,其高死亡率和高致残率在全世界范围内极大地威胁着人类健康,虽然随着近年来医疗水平不断进步情况有所缓解,但对于脑出血后的继发性脑损伤治疗效果仍不理想。脑出血后发生继发性脑损伤的机制复杂,包括... 详细信息

出血性脑卒中是常见的危急重症之一,其高死亡率和高致残率在全世界范围内极大地威胁着人类健康,虽然随着近年来医疗水平不断进步情况有所缓解,但对于脑出血后的继发性脑损伤治疗效果仍不理想。脑出血后发生继发性脑损伤的机制复杂,包括神经炎症、神经元凋亡、脑水肿等一系列病理生理反应,目前国内外研究表明神经炎症与出血性脑卒中患者神经功能损伤密切相关,因此亟待探索脑出血后神经炎症的分子机制并进行针对性地干预。小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞可通过吞噬细胞碎片等方式发挥调节神经元及其轴突的生长和发育的生理作用,在疾病条件下受刺激的小胶质细胞可通过TLR样受体介导的信号通路诱发炎症级联反应恶化神经功能。既往研究表明,对小鼠进行TLR4基因敲除或给予TLR4抑制剂治疗能通过抑制小胶质细胞的活化、减少促炎性炎症因子的产生从而发挥神经保护作用。因此,了解该免疫细胞的作用机制,特别是其在脑出血损伤后神经炎症反应中的作用有助于找到应对脑出血后过度的炎症反应及其造成的不利临床后果的治疗策略。比如通过解析细胞外信号触发小胶质细胞过度活化的分子基础,并了解参与这种信号传导的分子开关从而靶向抑制炎症反应改善预后。然而小胶质细胞参与调控神经炎症反应的机制还存在许多尚未明确的问题,这在一定程度上限制了基于靶向干预小胶质细胞的神经炎症反应实现临床治疗策略的发展。对出血性脑卒中期间小胶质细胞的作用机制进行深入研究,有助于探索神经炎症过程的分子,进而改善出血性脑卒中患者的预后。生物体细胞内的大多数mRNA前体在细胞核内进行转录后转运到细胞质中的特定位置进行加工从而产生成熟的mRNA,这一过程与其编码的蛋白质的翻译相匹配。成熟的mRNA必须定位到特定的位置才能发挥功能,如果mRNA在细胞核-质位置上的定位产生偏差,将会导致细胞的多种生命活动受影响,甚至对细胞的生命造成威胁。有研究观察到人类大脑发育过程中的RNA核保留现象并合理预测RNA在细胞核中错误定位可能与大脑发育失调疾病,如神经精神类疾病密切相关。此外,一些重要的分子生物学过程,如基因表达调控、蛋白质合成等过程都依赖于mRNA在细胞核-质位置上的动态变化。既往研究发现,成熟的mRNA在特定亚细胞水平的异常累积是一些神经退行性病变的关键致病因素之一。例如编码肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)的致病蛋白ALS相关蛋白TDP-43的mRNA在正常情况下定位在运动神经元细胞核但在ALS病人中错误地出现在细胞质并出现其蛋白团块积聚的病理改变。随着测序技术的发展,在出血性脑卒中领域对于多种细胞转录的研究也越来越细致,然而,目前的研究大多关注于细胞整体水平的转录组变化,对疾病状态下mRNA在亚细胞水平上的表达特征及功能却知之甚少。因此,为了更好地了解小胶质细胞细胞核-质RNA在脑出血后神经炎症发生发展中的作用,对这些细胞核-质差异基因进行全局剖析十分重要。本研究分为三个部分展开探讨。第一部分使用氧合血红蛋白(oxyhemoglobin,oxy-Hb)刺激小胶质细胞BV2旨在体外模拟脑出血后血肿成分刺激小胶质细胞导致的神经炎症,在该模型上实现细胞核-质亚细胞成分分离效果评估并验证炎症因子在亚细胞水平上的表达情况。第二部分利用全转录组测序技术结合生物信息学分析进一步研究细胞核-质差异基因在小胶质细胞神经炎症微环境中的作用。第三部分研究基于全转录组测序数据进一步分析细胞质和细胞核内的mRNA可变剪接事件,旨在揭示炎症基因参与神经炎症微环境的机制。1基于小胶质细胞神经炎症模型亚细胞组分分离方法的效果评估目的:分离出高纯度的细胞质与细胞核组分,并提取RNA和蛋白质进行实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)、RNA测序文库构建、蛋白质印迹法(Western blotting,WB)等后续实验。方法:1.在正常培养的小胶质细胞系BV2培养基中加入浓度为10uM的氧合血红蛋白(oxy-Hb),继续培养12小时或24小时,对照组(control)不加入oxy-Hb。2.通过显微镜观察小胶质细胞激活后的形态变化,用细胞增殖及细胞毒性检测法评估细胞活力,通过一氧化氮(NO)释放量检测NO产生情况,以及RT-qPCR检测小胶质细胞M1型和M2型激活标志物以及炎症因子的表达情况。3.对control组、oxy-Hb刺激12h及24h组小胶质细胞分别分离出细胞核和细胞质成分,利用DAPI染色、Western blotting以及RT-qPCR技术检测定位于细胞核或细胞质的蛋白质和RNA以评估亚细胞组分分离效果。结果:1.与control组相比较,oxy-Hb刺激后小胶质细胞形态上变化成典型阿米巴样激活形态,细胞活力随时间点逐渐减少(P<0.05),而NO的释放量则显著增加至12小时达顶峰(P<0.0

关键词：小胶质细胞神经炎症亚细胞组分分离炎症因子全转录组测序炎症微环境细胞核-质差异基因炎症微环境可变性剪接表观遗传学修饰

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