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口疮病毒B4R锚蛋白抑制细胞NF-κB信号通路的研究

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中国兽医科学 2016年第11期46卷 1412-1417页

作者：冯园贾怀杰何小兵成温玉陈国华王春燕何玉林景志忠桂林医学院微生物学教研室广西桂林541000 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃兰州730046

为明确口疮病毒(ORFV)编码的B4R蛋白调节细胞N F-κB活化的作用,以ORFV ORF008基因编码的B4R蛋白为研究对象,构建真核表达载体p CM V-Flag008,转染293T细胞,首先,利用双荧光素酶报告基因系统分析B4R蛋白对NF-κB信号活化的调节作用;其次... 详细信息

为明确口疮病毒(ORFV)编码的B4R蛋白调节细胞N F-κB活化的作用,以ORFV ORF008基因编码的B4R蛋白为研究对象,构建真核表达载体p CM V-Flag008,转染293T细胞,首先,利用双荧光素酶报告基因系统分析B4R蛋白对NF-κB信号活化的调节作用;其次,采用W estern-blot检测B4R蛋白对NF-κB信号通路中NF-κB p65蛋白核移位和IκBα蛋白磷酸化水平的影响。结果显示,B4R蛋白对NF-κB转录因子报告载体荧光素酶活性有明显的抑制作用(P<0.05);B4R蛋白能阻止IκBα蛋白磷酸化降解过程而抑制细胞NF-κB p65蛋白核移位。由此可见,ORFV编码的B4R蛋白能抑制细胞NF-κB信号通路的活化。

关键词：口疮病毒 NF-κB ORF008基因 B4R蛋白

口疮病毒VIR蛋白多克隆抗体的制备及VIR蛋白的亚细胞定位观察

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中国兽医科学 2014年第11期44卷 1160-1165页

作者：成伟伟刘永杰孔汉金尚佑军刘湘涛刘磊张克山甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

为研究口疮病毒VIR蛋白的生物学特性,构建了含有VIR基因的重组表达质粒pET-VIR和含有绿色荧光蛋白融合真核重组质粒pEGFP-VIR;诱导表达和纯化VIR蛋白,并用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定抗体效价,用Western... 详细信息

为研究口疮病毒VIR蛋白的生物学特性,构建了含有VIR基因的重组表达质粒pET-VIR和含有绿色荧光蛋白融合真核重组质粒pEGFP-VIR;诱导表达和纯化VIR蛋白,并用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定抗体效价,用Western-blot鉴定抗体的反应原性。利用脂质体介导法将pEGFP-VIR质粒转染绵羊睾丸细胞,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核染色后激光扫描共聚焦显微镜观察VIR在细胞内的表达和亚细胞定位。结果显示,表达和纯化了含有GST标签的GSTVIR蛋白,主要以可溶性形式存在,其分子质量约27ku,制备的多克隆抗体效价达1∶218;Western-blot分析结果显示,此多克隆抗体有较好的特异性反应;VIR蛋白主要定位于细胞核内。本试验结果为VIR生物学功能的深入研究奠定了基础。

关键词：口疮病毒 VIR蛋白抗体亚细胞定位

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口疮病毒ORF020基因的原核表达与纯化

中国兽医科学 2016年第8期46卷 1015-1019页

作者：李亚颖崔克庞峰李国华彭冬梅赵天靖朱华培徐开莲朱姝杨小健聂鑫曹瑞勇王凤阳杜丽海南大学农学院海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室海口市动物基因工程重点实验室海南海口570228 海南省现代农业检验检测预警防控中心海南海口571100

根据Gen Bank中口疮病毒ORF020基因序列,利用DNAMAN软件设计引物,以口疮病毒基因组为模板,采用PCR扩增出552bp的目的基因片段。凝胶回收纯化目的片段,将其连接入p MD20-T载体,转化*** DH5α并测序。测序正确后再其再连接入p ET-28a(+)... 详细信息

根据Gen Bank中口疮病毒ORF020基因序列,利用DNAMAN软件设计引物,以口疮病毒基因组为模板,采用PCR扩增出552bp的目的基因片段。凝胶回收纯化目的片段,将其连接入p MD20-T载体,转化*** DH5α并测序。测序正确后再其再连接入p ET-28a(+)表达载体,构建重组质粒p ET28a(+)-ORF020,转化入*** BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE和Western-blot鉴定诱导表达的目的蛋白,镍亲和层析纯化目的蛋白。结果表明,成功构建了原核表达载体p ET28a(+)-ORF020,并在*** BL21中表达了ORF020基因,诱导得到的融合蛋白与目的蛋白大小一致,证明目的基因被成功表达并得到纯化蛋白。上述研究结果为开展ORF020的功能研究奠定了一定基础。

关键词：绵羊山羊口疮病毒 ORF020基因原核表达蛋白纯化

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口疮病毒XC13株的分离鉴定

中国兽医科学 2015年第5期45卷 469-473页

作者：邓宇西昌学院动物科学学院四川西昌615013

采用MDBK细胞对西昌市某山羊场疑似患有口疮的山羊病料进行分离培养,经动物回归试验、PCR、遗传进化分析等对分离毒株进行鉴定。结果表明,病料在MDBK细胞上产生致细胞病变;接种病料的山羊出现典型的传染性脓疱;PCR从分离毒株中扩增出F1... 详细信息

采用MDBK细胞对西昌市某山羊场疑似患有口疮的山羊病料进行分离培养,经动物回归试验、PCR、遗传进化分析等对分离毒株进行鉴定。结果表明,病料在MDBK细胞上产生致细胞病变;接种病料的山羊出现典型的传染性脓疱;PCR从分离毒株中扩增出F1L基因片段,该基因片段序列与口疮病毒(ORFV)参考株FJ-SL2、FJ-SL1的核苷酸序列的同源性分别为99.8%、99.5%,亲缘关系较近,遗传进化分析处于同一分支上。本研究从疑似口疮病料中成功分离鉴定出1株口疮病毒,遂将其命名为ORFV XC13。

关键词：口疮病毒分离鉴定 F1L基因

口疮病毒GIF蛋白的原核表达及对小鼠免疫细胞的影响

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中国兽医科学 2019年第10期49卷 1222-1232页

作者：冯倩吴锦艳李玲霞杜国玉尚佑军刘湘涛刘永生中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室

探究口疮病毒GIF蛋白对小鼠骨髓源树突状细胞成熟及Naive CD4^+T细胞极化作用的影响。原核表达口疮病毒GIF蛋白,用纯化后的蛋白刺激小鼠树突状细胞,利用流式细胞术检测细胞表面分子的表达情况,ELISA方法检测细胞培养上清中细胞因子IL-12... 详细信息

探究口疮病毒GIF蛋白对小鼠骨髓源树突状细胞成熟及Naive CD4^+T细胞极化作用的影响。原核表达口疮病毒GIF蛋白,用纯化后的蛋白刺激小鼠树突状细胞,利用流式细胞术检测细胞表面分子的表达情况,ELISA方法检测细胞培养上清中细胞因子IL-12P40、TNF-α、IL-10、IL-1β的分泌情况。将Naive CD4^+T细胞与经不同质量浓度的GIF蛋白刺激后的树突状细胞共培养,用ELISA检测该树突状细胞对Naive CD4^+T细胞的免疫刺激能力,并进一步检测培养上清中IFN-γ和IL-5的分泌水平。结果显示,成功克隆了ORFV117基因,表达了羊口疮病毒GIF蛋白。经不同质量浓度蛋白刺激后,树突状细胞的表面共刺激分子CD86、CD40的表达水平均明显升高,其中5μg/mL蛋白刺激后,MHCⅡ表达水平显著升高,IL-12P40、TNF-α、IL-1β、IL-10释放水平显著升高。经不同质量浓度的GIF重组蛋白刺激后的树突状细胞对Naive CD4^+T细胞的刺激能力增强,淋巴细胞共培养上清中IFN-γ分泌量显著增加。这表明一定质量浓度的口疮病毒GIF蛋白能促进小鼠骨髓源树突状细胞的成熟,能够激活抗原递呈作用,并且具有刺激T细胞分化的能力。

关键词：口疮病毒 GIF蛋白纯化树突状细胞

口疮病毒B2L蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

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中国兽医科学 2017年第2期47卷 150-156页

作者：庞文静张琪郭抗抗何亚鹏付明哲许信刚西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

将口疮病毒(orf virus,ORFV)ORFV B2L蛋白基因克隆至原核表达载体p ET-28a(+)中进行重组B2L蛋白的诱导表达;对纯化复性后的B2L蛋白进行Western-blot鉴定;用复性后的B2L蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立检测血清ORFV抗体水平的间接ELI... 详细信息

将口疮病毒(orf virus,ORFV)ORFV B2L蛋白基因克隆至原核表达载体p ET-28a(+)中进行重组B2L蛋白的诱导表达;对纯化复性后的B2L蛋白进行Western-blot鉴定;用复性后的B2L蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立检测血清ORFV抗体水平的间接ELISA,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测。结果,原核表达出42 ku的重组B2L蛋白。Western-blot结果表明,重组蛋白具有良好的特异性和抗原反应性。最佳优化反应条件为:抗原包被量每孔600 ng,血清以1∶200倍稀释作用1 h,酶标二抗以1∶5 000倍稀释作用30 min,TMB显色时间为10 min。在该优化条件下,D_(450)≥0.342为阳性,D_(450)<0.342为阴性;特异性试验表明,此间接ELISA对其他阳性血清的检测结果为阴性;对121份阳性血清进行检测,敏感性为99.2%;重复性试验表明,批内和批间D_(450)值的变异系数分别在1.81%~6.23%和1.70%~7.45%之间。本试验建立的体系对临床上676份山羊血清样品进行检测,阳性率为99.4%。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA可用于ORFV抗体的检测。

关键词：山羊绵羊口疮病毒 B2L蛋白原核表达间接ELISA

口疮病毒四川流行株的分离鉴定及其遗传进化分析

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中国兽医科学 2019年第7期49卷 871-878页

作者：毛从剑张兴民黄忍向华张焕容西南民族大学生命科学与技术学院

为了解四川地区口疮病毒(ORFV)流行毒株的遗传变异情况,从当地4个黑山羊养殖场采集疑似ORFV感染的羔羊唇部结痂组织,通过MDBK细胞分离培养、PCR、病毒效价测定、间接免疫荧光试验等方法进行分离鉴定,并对分离毒株的保护性抗原基因B2L、... 详细信息

为了解四川地区口疮病毒(ORFV)流行毒株的遗传变异情况,从当地4个黑山羊养殖场采集疑似ORFV感染的羔羊唇部结痂组织,通过MDBK细胞分离培养、PCR、病毒效价测定、间接免疫荧光试验等方法进行分离鉴定,并对分离毒株的保护性抗原基因B2L、F1L进行克隆与序列分析。结果表明,成功分离到4株ORFV,并将其分别命名为SC-LZ1、SC-LZ2、SC-PZH1、SC-PZH2。序列分析结果显示,这4株分离毒株保护性抗原基因B2L、F1L相对保守,其B2L、F1L基因编码的氨基酸序列与参考株的同源性分别为96.3%~100%和94.2%~100%。本研究为四川地区羊口疮的防制奠定了基础。

关键词：口疮病毒检测分离鉴定遗传进化分析

口疮病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

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中国兽医科学 2020年第2期50卷 168-175页

作者：孙正楠张焕容西南民族大学生命科学与技术学院

为建立检测口疮病毒(orf virus,ORFV)抗体的间接ELISA方法,原核表达口疮病毒B2L蛋白与6×组氨酸标签的重组蛋白;对纯化复性后的重组B2L蛋白进行Western-blot鉴定;用复性后的重组B2L蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立检测ORFV抗体的间... 详细信息

为建立检测口疮病毒(orf virus,ORFV)抗体的间接ELISA方法,原核表达口疮病毒B2L蛋白与6×组氨酸标签的重组蛋白;对纯化复性后的重组B2L蛋白进行Western-blot鉴定;用复性后的重组B2L蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立检测ORFV抗体的间接ELISA,并进行特异性、灵敏度和重复性评价,最后应用所建立的间接ELISA对来自四川部分地区的384份山羊血清样品进行检测。结果显示,成功原核表达出42 ku的重组ORFV B2L蛋白。Western-blot结果表明,重组蛋白具有良好的抗原反应性。间接ELISA最佳反应条件为:包被抗原质量浓度为5μg/m L,1∶100稀释血清作用2 h,酶标二抗以1∶2000稀释作用30 min,TMB显色时间为15 min。在该优化条件下,D450≥0.31为阳性。该方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性。临床样品的间接ELISA检测结果显示,总阳性率为66.67%(256/384),其中未接种过疫苗的羊只抗体阳性率为34.81%(55/158)。上述结果表明,建立的间接ELISA可用于ORFV抗体的检测,四川部分地区山羊场羊只感染野毒的概率较大,疫苗免疫效果不佳。

关键词：山羊口疮病毒重组B2L蛋白原核表达间接ELISA

口疮病毒VEGF基因的原核表达及亚细胞定位

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中国兽医科学 2017年第2期47卷 179-184页

作者：殷冬冬杨侃侃白彩霞赵玉洁潘飞徐燕华梅跃辉苏莉钟灵毓崔佣楸张子军祁克宗王桂军王勇安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036

为了对口疮病毒(ORFV)VEGF基因进行原核表达和亚细胞定位研究,PCR扩增VEGF基因,并将其分别克隆至原核表达载体p ET-32a(+)和真核表达载体p EGFP-C3中。将原核表达重组质粒转化至*** Rosseta感受态细胞中,经IPTG诱导表达目的蛋白。将表... 详细信息

为了对口疮病毒(ORFV)VEGF基因进行原核表达和亚细胞定位研究,PCR扩增VEGF基因,并将其分别克隆至原核表达载体p ET-32a(+)和真核表达载体p EGFP-C3中。将原核表达重组质粒转化至*** Rosseta感受态细胞中,经IPTG诱导表达目的蛋白。将表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体血清,并利用琼脂扩散试验检测其效价。将真核表达重组质粒转染BHK21细胞,利用激光共聚焦观察VEGF蛋白在BHK21细胞中的亚细胞定位。结果表明:VEGF蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,主要以包涵体形式表达,蛋白分子质量大小约为33 ku。Western-blot结果表明,VEGF蛋白具有良好的反应原性,制备的多克隆抗体效价达1∶8。VEGF蛋白在转染BHK21细胞后主要在细胞质中表达,且能够与制备的多抗血清反应。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了一定的基础。

关键词：口疮病毒 VEGF基因原核表达亚细胞定位