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叠氮溴化丙锭与实时荧光定量PCR结合检测地衣芽孢杆菌活菌制品中金黄色葡萄球菌

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中国药学杂志 2022年第3期57卷 231-236页

作者：王银环郑小玲阮昊贾晓力浙江省食品药品检验研究院杭州310004 国家药品监督管理局药品微生物检测与预警重点实验室杭州310004 济南职业学院济南250000

目的排除样品中高浓度活菌和大量辅料及死菌DNA的干扰,检测地衣芽孢杆菌活菌胶囊中金黄色葡萄球菌。方法将叠氮溴化丙锭(PMA)、实时荧光定量PCR(qPCR)和微孔膜过滤法相结合,收集滤液后离心,富集菌体,优化PMA工作浓度、暗孵育时间和曝光... 详细信息

目的排除样品中高浓度活菌和大量辅料及死菌DNA的干扰,检测地衣芽孢杆菌活菌胶囊中金黄色葡萄球菌。方法将叠氮溴化丙锭(PMA)、实时荧光定量PCR(qPCR)和微孔膜过滤法相结合,收集滤液后离心,富集菌体,优化PMA工作浓度、暗孵育时间和曝光时间,确定PMA最佳处理方案。采用不同浓度金黄色葡萄球菌的死菌与活菌进行PMA-qPCR方法验证,同时考察方法灵敏度和特异性。结果样品采用5.0μm的聚醚砜膜过滤,辅料截留率和滤液活菌计数最高。PMA工作质量浓度40μg·mL^(-1),暗孵育时间10 min,曝光时间10 min为最佳处理方案,该处理方案下PMA既不影响活菌DNA的PCR扩增,又能进入死菌中结合DNA抑制其扩增。本法高效快速、实时准确,全过程筛选鉴定只需4 h,最低检测限为1×10^(4)CFU·mL^(-1)。结论本法灵敏度高、特异性强,适用于地衣芽孢杆菌活菌制品中金黄色葡萄球菌的检测。

关键词：叠氮溴化丙锭实时荧光定量PCR 微生态活菌制品地衣芽孢杆菌活菌胶囊金黄色葡萄球菌

叠氮溴化丙锭-荧光定量PCR法实时快速检测5种乳杆菌活菌数方法的建立与应用

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微生物学通报 2020年第12期47卷 4317-4327页

作者：段亮杰沙雨婷罗意夏小乐江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

【背景】乳杆菌属是发酵食品中最常见的微生物之一,与食品的品质和安全密切相关,定量检测乳杆菌活菌数、解析乳杆菌群落组成对发酵乃至肠道微生物等具有重要意义。【目的】建立一种在种水平上定量检测5种乳杆菌活菌数的叠氮溴化丙锭-荧... 详细信息

【背景】乳杆菌属是发酵食品中最常见的微生物之一,与食品的品质和安全密切相关,定量检测乳杆菌活菌数、解析乳杆菌群落组成对发酵乃至肠道微生物等具有重要意义。【目的】建立一种在种水平上定量检测5种乳杆菌活菌数的叠氮溴化丙锭-荧光定量PCR(propidium monoazide-quantitative PCR,PMA-qPCR)检测方法并探讨其适用性。【方法】以植物乳杆菌、发酵乳杆菌、短乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌等发酵食品中常见的5种乳杆菌为目标菌株,查找并筛选特异性引物用于荧光定量PCR(qPCR)检测,优化叠氮溴化丙锭(PMA)处理条件,测定PMA-qPCR检测法的特异性、灵敏度及可靠性。最后利用PMA-qPCR法检测黄酒酿造过程中5种乳杆菌的活菌数。【结果】PMA最佳处理条件为:浓度20μmol/L下暗处理15 min后曝光15 min,此时可抑制样品中99.89%的死菌DNA扩增。该方法特异性高,能够准确识别5种乳杆菌;线性关系强,R2>0.98;灵敏度高,检测限为101.8-103.2 CFU/mL;重复性好,Cq值变异系数小于1%;与平板计数相比差异不显著(统计学上),P>0.05。利用该方法检测黄酒中5种乳杆菌的活菌数,发现发酵乳杆菌、干酪乳杆菌和短乳杆菌是主要的乳杆菌(总计占比59%-89%),与已知黄酒酿造中乳杆菌群落组成相符。【结论】建立的PMA-qPCR法能够快速、准确地检测5种乳杆菌的活菌数,为解析样品中乳杆菌的实时组成及检测具有活性但不可培养(viable but nonculturable,VBNC)状态的乳杆菌提供了可靠的手段。

关键词：乳杆菌活菌叠氮溴化丙锭荧光定量PCR 实时快速检测

叠氮溴化丙锭-qPCR法定量检测植物乳杆菌

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食品安全质量检测学报 2021年第12期12卷 4867-4875页

作者：马丹杨彬彬陶文靖郭敏卓张捷魏咏新李丹魏海燕曾静中国海关科学技术研究中心北京100026 优合集团有限公司深圳518063 北京美正生物科技有限公司北京102100

目的将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)相结合,建立一种活性植物乳杆菌定量检测的PMA-qPCR方法。方法首先进行引物探针特异性验证,优化PMA反应条件,建立标准曲线,验证灵敏度,然后将该方法用于检测人工添加奶粉、米粉、酸奶样品以及冻干样品中的植物乳杆菌。结果最佳PMA浓度为2μg/mL,最佳曝光时间为10 min,建立的PMA-qPCR方法可以快速、高效、特异地检测植物乳杆菌,利用细菌纯培养物与对应Ct值建立标准曲线,可以看出纯培养物浓度与Ct值之间存在对应线性关系,相关系数(r^(2))为0.9992,最低检测限为15拷贝/反应体系,人工添加样品以及冻干样品检测中PMA-qPCR和平皿计数法结果的对数值进行配对t检验,显示在不同的人工添加样本以及冻干样品中均无显著性差异(P>0.05)。结论本研究建立的PMA-qPCR检测方法能快速、准确、特异、灵敏地定量检测活性植物乳杆菌。

关键词：叠氮溴化丙锭植物乳杆菌实时荧光定量PCR

叠氮溴化丙锭-羟基萘酚蓝-环介导等温扩增法检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌

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肉类研究 2020年第5期34卷 48-52页

作者：戴小芳陈琼董华夏向春燕虞伟明郦娟武汉食品化妆品检验所湖北武汉430012

将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)、羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)与环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术相结合,建立一种可视化PMA-HNB-LAMP方法快速检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)。结果表明,当PMA终质量浓度为5.0μg/mL、孵育和曝光时间均为15 min时,可有效抑制10~5 CFU/m L的单核细胞李斯特菌死菌DNA的聚合酶链式反应扩增,而对活菌DNA的扩增不具有抑制作用。LAMP反应体系中HNB终浓度为210μmol/L时,检测显色结果肉眼可见。该方法的纯菌液灵敏度为2.4×10~2 CFU/m L,人工污染肉制品的检出限为2.3×10~4 CFU/m L。分别采用国标法、PMA-HNB-LAMP法和HNB-LAMP法检测20份市售畜禽肉样,3种方法的单核细胞李斯特菌检出率分别为5%、10%和20%。PMA-HNB-LAMP法在一定程度上可解决LAMP法的假阳性问题,并且具有操作简单、可视性强的优点。

关键词：单核细胞李斯特菌叠氮溴化丙锭羟基萘酚蓝环介导等温扩增畜禽肉

叠氮溴化丙锭（PMA）应用于南美白对虾中食源性致病菌活菌检测及微生物多样性分析的研究

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叠氮溴化丙锭（PMA）应用于南美白对虾中食源性致病菌活菌检测及...

作者：肖莉莉上海海洋大学

学位级别：硕士

南美白对虾因其味道鲜美、营养丰富,一直深受中国及其亚洲其他地区消费者的青睐。然而,也正因为其丰富的营养成分,成为微生物聚集和居住的最佳场所。其中,副溶血性弧菌和沙门氏菌是南美白对虾中最为常见的两种食源性致病菌,成为食物中... 详细信息

南美白对虾因其味道鲜美、营养丰富,一直深受中国及其亚洲其他地区消费者的青睐。然而,也正因为其丰富的营养成分,成为微生物聚集和居住的最佳场所。其中,副溶血性弧菌和沙门氏菌是南美白对虾中最为常见的两种食源性致病菌,成为食物中毒事件的重要威胁因子。此外,由微生物活动引起的食品腐败变质问题,也对食品品质安全和人生财产安全提出了严重挑战,阻碍了相关产业发展,给国民经济造成了一定程度的负面影响。为了解决这些潜在威胁,建立有效的微生物监测技术一直成为食品行业关注的焦点问题。叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)是一种对核酸具有高度亲和力的光敏反应染料,能够进入具有不完整细胞壁或细胞膜的细菌死细胞中,选择性地交联死菌DNA。将其与DNA扩增检测技术相结合,可有效地抑制死菌细胞DNA的扩增,从而实现活菌检测。因此,本文旨在(1)构建一种活菌定量检测技术用于生鲜南美白对虾中沙门氏菌的快速检测;(2)构建一种高通量活菌定量技术用于同时定量检测生鲜南美白对虾中活的副溶血性弧菌和沙门氏菌并建立两种高效冷杀菌技术(超高压和酸性电解水)失活模型;(3)构建一种活菌前处理结合高通量测序技术用于描述采收后南美白对虾在贮藏期间真实存在的微生物多样性变化。本课题主要研究内容和研究结果如下:***应用于生鲜南美白对虾中沙门氏菌活菌定量检测方法的构建本研究构建了一种PMA结合荧光定量PCR方法,以快速定量检测生鲜南美白对虾中沙门氏菌活菌。通过源于23种60株的受试菌株的验证试验,证明该方法具有较高的特异性。经PMA浓度优化实验,确定100μM为最佳PMA使用浓度,与荧光定量PCR技术相结合,可有效抑制106 CFU/m L沙门氏菌死菌DNA的扩增,与先前研究相比,可显著提高沙门氏菌死菌抑制性。此外,沙门氏菌在纯培养和人工接种虾样中的最低检测限分别为36 CFU/g和100CFU/g。最后,运用PMA-q PCR、q PCR及传统涂布法对含不同死活菌比例生虾样品的检测结果进行验证,结果显示该方法与传统涂布方法的结果没有显著性差异,而显著优于荧光定量PCR检测结果。总之,本研究构建的PMA结合荧光定量PCR技术可为水产品中沙门氏菌的活菌定量提供一个有效的检测工具。***应用于生鲜南美白对虾中副溶血性弧菌及沙门氏菌活菌定量方法的构建本研究构建了一种PMA前处理结合多重荧光定量PCR活菌检测方法,用于同时定量检测生鲜南美白对虾中活的副溶血性弧菌和沙门氏菌。通过PMA前处理优化试验,确定100μM PMA浓度和15 min暗处理时间为PMA最优的前处理条件,与多重荧光定量PCR技术相结合,可有效抑制106 CFU/m L副溶血性弧菌和沙门氏菌死菌DNA的扩增。经68株受试菌株的验证试验,证明该方法具有较高的特异性。通过建立这两种菌在纯培养和人工接种虾样中的标准曲线,确定该方法具有良好的扩增效率,并获得较低的检测限。此外,该方法应用于构建超高压及酸性电解水技术杀菌失活模型的结果显示,PMA结合多重q PCR的致死率(D10)与传统平板计数结果一致,且显著优于多重q PCR结果。总之,本研究构建的新型多重活菌定量技术快速有效,可为水产品中常见食源性致病菌的检测及冷杀菌技术杀菌效果的评价提供一种有效的工具,从而保障水产品质量和改善公共卫生。3.基于PMA前处理技术结合高通量测序分析采收后南美白对虾贮藏过程中微生物多样性的变化本研究分析了采收后南美白对虾在不同温度下(4、7、15、30oC)自然存在的微生物多样性变化。基于PMA前处理技术,去除菌体中的死菌,提取获得菌体中活菌基因组,再经第二代高通量测序技术(Illumina Hi Seq2000/2500/4000)对基因组进行16s r DNA测序,并根据分析要求绘制成多样本群落组成柱状图、PCA图、热图、Venn图等。结果显示,样品经过PMA前处理与未经过PMA前处理在微生物群落结构上存在明显差异,主要表现在微生物种类以及物种丰度上的差异。此外,温度越高这种差异越小,表明PMA对低温条件下微生物菌群多样性分析有较好的修正作用。为了探究食品腐败的原因,本研究分析比较各个样本主要微生物物种类别以及丰度,结果显示Exiguobacterium(微杆菌属)、Vibrio(弧菌属)、Lactococcus(乳酸菌属)、Aeromonas(气单胞菌属)、Shewanella(希瓦氏菌属)、Kurthia(库特氏菌属)、Enterococcus(肠球菌属)等是所有样本的共同优势菌。本研究所运用的PMA前处理结合高通量测序不仅能为食品冷链物流提供良好的技术支持,还为研究南美白对虾在贮藏期间发生腐败变质机理的研究提供有效的数据基础。我们相信,本课题的研究能够推动基于PMA前处理的活菌定量检测、水产品贮藏期间群落结构变

关键词：南美白对虾叠氮溴化丙锭荧光定量PCR 冷杀菌技术高通量测序微生物多样性

叠氮溴化丙锭结合高通量测序技术分析风干农田土壤中活性微生物

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叠氮溴化丙锭结合高通量测序技术分析风干农田土壤中活性微生物

作者：孔令辉东北农业大学

学位级别：硕士

土壤微生物总DNA主要来源于胞外DNA以及活性和非活性微生物群,因此,单纯基于土壤微生物总DNA的研究无法反映出土壤中真实的活性微生物群,极易造成土壤微生物丰度及群落多样性的高估,但目前尚没有准确可行的方法筛选土壤活性微生物群。... 详细信息

土壤微生物总DNA主要来源于胞外DNA以及活性和非活性微生物群,因此,单纯基于土壤微生物总DNA的研究无法反映出土壤中真实的活性微生物群,极易造成土壤微生物丰度及群落多样性的高估,但目前尚没有准确可行的方法筛选土壤活性微生物群。本项目拟利用叠氮溴化丙锭(Propidium Monoazide,PMA)对受损细胞的胞内DNA和游离DNA特异结合的能力,将其用于风干保存策略下土壤样品活性微生物的检测,并揭示其对风干土中活性微生物群落结构和多样性检测的效果。本研究的开展为土壤活性微生物生态学研究提供新的理论和方法,同时为土壤样品风干保存策略在微生物生态学中的应用提供重要参考。本研究主要结果如下:(1)风干保存降低了土壤中的养分含量,但提升了土壤硝态氮的含量,施肥对农田土壤的养分具有提升作用。化肥降低了土壤pH,经风干保存后由5.08继续下降至5.02,其余处理的pH均上升,其中有机肥处理由5.97上升至6.17;原位土壤中铵态氮和硝态氮含量分别在单施化肥和单施有机肥的情况下最高,风干保存后配施化肥与有机肥土壤对两种养分的持留效果最高,含量最高;总氮和总碳含量分别在原位土壤的单施化肥处理和单施有机肥处理中最好,风干保存后虽然含量下降,但仍是各施肥处理中最高的。(2)经风干保存并添加PMA的四种施肥处理土壤中微生物群落组成结构显著不同。不同施肥处理下细菌丰富度、多样性和系统发育多样性最高的处理组依次为单施有机肥、对照组和单施有机肥;真菌为对照组、单施有机肥和对照组。活性细菌门类以变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)和厚壁菌门(Firmicutes)为主,对照组和单施有机肥处理组中变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度最高,单施化肥和配施化肥、有机肥处理组中放线菌门(Actinobacteriota)相对丰度最高,同时厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度高于另外两个处理组;活性细菌属类以未分类的微球菌科(unclassified＿f＿＿Micrococcaceae)、马赛菌属(Massilia)和芽孢杆菌属(Bacillus)为主,单施有机肥处理组中马赛菌属(Massilia)相对丰度最高,其余三组均为未分类的微球菌科(unclassified＿f＿＿Micrococcaceae)相对丰度最高;活性真菌门类以子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)为主,四个处理组均为子囊菌门(Ascomycota)相对丰度最高;活性真菌属类以亚隔孢壳属(Didymella)、短柄菌属(Solicoccozyma)为主,四个处理组中相对丰度最高菌属均为亚隔孢壳属(Didymella),另外隐球菌属(Cryptococcus＿f＿＿Cryptococcaceae)和Rhodosporidiobolus仅在配施化肥、有机肥处理组中存活,且相对丰度高于短柄菌属(Solicoccozyma)。基于Bray-Curtis距离的PCo A和Per MANOVA分析表明,对照组和单施有机肥处理组的微生物群落结构组成相似,单施化肥和配施化肥、有机肥处理组的微生物群落结构组成相似。(3)风干土壤中relic DNA的存在干扰了活性微生物群落的组成以及多样性。与添加PMA风干土壤比较可以发现,relic DNA抑制了风干土壤中细菌的丰富度以及细菌和真菌的多样性,施肥可以缓解以上抑制效果;relic DNA提高了真菌的丰富度,但施肥处理会加重这种情况。添加PMA前后占比较高的成员相同,施肥加剧了变形菌门(Proteobacteria)中马赛菌属(Massilia)相对丰度的高估,配施化肥与有机肥处理提升最高,施肥造成放线菌门(Actinobacteriota)中未分类的微球菌科(unclassified＿f＿＿Micrococcaceae)相对丰度的低估,且单施化肥最明显;单施有机肥加剧了子囊菌门(Ascomycota)中亚隔孢壳属(Didymella)相对丰度的高估,单施化肥和配施化肥、有机肥减缓了高估,单施化肥效果最好,单施有机肥加剧了担子菌门(Basidiomycota)中短柄菌属(Solicoccozyma)相对丰度的低估,单施化肥和配施化肥、有机肥减缓了低估,其中后一种效果最好。结合PCo A和Per MANOVA检验可以看出,添加PMA前后,风干土壤的细菌群落结构在单施化肥和单施有机肥处理组中差异显著,真菌在对照组和配施化肥、有机肥处理组中差异显著。(4)PMA可以完善风干保存土壤中微生物的检测。原位土壤经风干保存后,微生物群落丰富度、多样性以及系统发育多样性显著降低,然而在添加PMA后,四种施肥条件中细菌改善效果最好的均为对照组,真菌为配施化肥与有机肥、对照组和单施

关键词：风干土样施肥高通量测序活性微生物叠氮溴化丙锭

基于叠氮溴化丙锭结合高通量测序技术分析口腔综合治疗台水路系统中活菌多样性的研究

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南京医科大学学报（自然科学版） 2021年第6期41卷 847-855页

作者：周如玉平逸帆张元王娟南京医科大学口腔疾病研究江苏重点实验室江苏南京210029 南京医科大学附属口腔医院牙体牙髓病科江苏南京210029 南京医科大学附属口腔医院正畸科江苏南京210029

目的:利用叠氮溴化丙锭(propidium monoazid,PMA)预处理方法结合高通量测序技术检测口腔综合治疗台水路系统(dental unit waterline,DUWL)中活菌微生物群落,以综合评估不同科室DUWL中的污染情况及探究活菌群落构成的多样性。方法:选择... 详细信息

目的:利用叠氮溴化丙锭(propidium monoazid,PMA)预处理方法结合高通量测序技术检测口腔综合治疗台水路系统(dental unit waterline,DUWL)中活菌微生物群落,以综合评估不同科室DUWL中的污染情况及探究活菌群落构成的多样性。方法:选择南京医科大学附属口腔医院33台口腔综合治疗台,牙体牙髓病科23台(E组),牙周病科10台(P组),在医院开诊前收集三用枪水样,PMA预处理水样后提取活菌总DNA,经细菌通用引物PCR扩增后构建宏基因组文库,用于高通量测序和生物信息学分析。结果:样本使用1μL PMA(最终浓度20μmol/L)预处理10 min后暴露于卤素光照射5 min,最适合检测DUWL样品中活菌的量;高通量测序显示DUWL中活菌微生物群落呈多样性,并具有潜在的细菌致病序列。科室间具有统计学差异的菌门为蓝藻菌门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、衣原体门(Chlamydiae)、Aerophobetes、绿弯菌门(Chloroflexi)、Bacteriadnorankk_unclassified、TM6(P <0.05);属水平上,军团菌属(Legionella)、Methyloversatilis、Obscuribacterales_norank差异有统计学意义(P <0.05)。结论:DUWL中致病微生物的存在对牙科医务工作者和患者都具有潜在感染风险,应重视DUWL细菌群落的多样性,有必要对DUWL进行定期水质控制。

关键词：叠氮溴化丙锭高通量测序口腔综合治疗台水路系统微生物多样性

叠氮溴化丙锭结合qPCR检测与区分活菌和死菌的研究进展

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微生物学免疫学进展 2020年第6期48卷 63-68页

作者：陶怡君(综述) 谌志筠(审校) 何秋水(审校) 首都医科大学基础医学院北京100069 首都医科大学基础医学院病原生物学系北京100069 芬兰图尔库大学医学微生物和免疫学系芬兰图尔库20520

活菌的检测是病原菌检验的关键,目前快速、灵敏、特异和准确的检测方法,如定量聚合酶链反应(quantitative PCR,qPCR)是微生物检测领域关注的焦点之一。其中,基于核酸结合染料如以叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)预处理的定量聚... 详细信息

活菌的检测是病原菌检验的关键,目前快速、灵敏、特异和准确的检测方法,如定量聚合酶链反应(quantitative PCR,qPCR)是微生物检测领域关注的焦点之一。其中,基于核酸结合染料如以叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)预处理的定量聚合酶链反应(PMA-qPCR)已广泛应用于多种病原菌活菌的检测,但仍然存在一定的局限性。现就PMA-qPCR检测与区分活菌(living bacteria)和死菌(dead bacteria)的研究进展作一综述。

关键词：叠氮溴化丙锭定量聚合酶链反应检测区分活菌死菌

叠氮溴化丙锭筛选环境活性微生物的原理及其应用

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土壤与作物 2021年第3期10卷 306-313页

作者：胡晓婧白鑫曲娟娟刘俊杰孔令辉王光华中国科学院东北地理与农业生态研究所黑土区农业生态重点实验室黑龙江哈尔滨150081 东北农业大学资源与环境学院黑龙江哈尔滨150030

环境微生物总DNA主要来源于游离DNA以及活性和非活性微生物群。因此,单纯基于环境微生物总DNA的直接研究技术可能无法反映出环境中真实的活性微生物群落结构及组成,极易造成微生物丰度及群落多样性的高估,急需建立有效可行的活性微生物... 详细信息

环境微生物总DNA主要来源于游离DNA以及活性和非活性微生物群。因此,单纯基于环境微生物总DNA的直接研究技术可能无法反映出环境中真实的活性微生物群落结构及组成,极易造成微生物丰度及群落多样性的高估,急需建立有效可行的活性微生物筛选方法。叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide,PMA)是一种能够不可逆地共价结合死细胞DNA和胞外DNA(统称为relic DNA)的光敏性核酸染料,致使relic DNA被钝化,不能完成PCR扩增。基于此,结合后续荧光定量PCR和高通量测序等分子生物学技术,可快速、准确且高效地筛选区分出环境样本中的活性微生物类群。本文针对近几年关于PMA染料法在底泥、土壤和水体等常见环境样品中的应用研究结果进行综述,并探讨了目前PMA染料法应用中存在的问题,提出了相应的改进和完善对策,为深入研究复杂环境样品活性微生物类群及其结构功能提供了新思路。

关键词：叠氮溴化丙锭环境微生物活性细胞检测 qPCR 高通量测序