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变异链球菌聚酮/非核糖体肽类次级代谢产物研究进展

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四川大学学报（医学版） 2023年第3期54卷 685-691页

作者：张梦碟程兴群徐欣口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科成都610041 口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院老年口腔科成都610041

龋病是在以细菌为主的多因素影响下,牙体硬组织发生的慢性感染性疾病。变异链球菌被认为是引起龋病的主要病原体。次级代谢产物是由变异链球菌合成的一类小分子化合物,包括细菌素和聚酮/非核糖体肽。目前已发现的变异链球菌聚酮/非核糖... 详细信息

龋病是在以细菌为主的多因素影响下,牙体硬组织发生的慢性感染性疾病。变异链球菌被认为是引起龋病的主要病原体。次级代谢产物是由变异链球菌合成的一类小分子化合物,包括细菌素和聚酮/非核糖体肽。目前已发现的变异链球菌聚酮/非核糖体肽类次级代谢产物主要有mutanobactin、mutanocyclin和mutanofactin,分别由mub、muc和muf基因簇合成,参与细菌菌种间竞争、氧化应激、生物膜形成等多项生理活动。本文就变异链球菌3种主要聚酮/非核糖体肽类次级代谢产物mutanobactin、mutanocyclin和mutanofactin的合成、功能和调控等方面进行综述,为进一步研究变异链球菌致龋机制和龋病防治提供新的思路。

关键词：龋病变异链球菌次级代谢产物聚酮非核糖体肽

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变异链球菌氧化应激调控机制的研究进展

口腔疾病防治 2023年第4期31卷 295-300页

作者：宁佳胡欣程兴群天津医科大学口腔医院综合科天津300070 四川大学华西口腔医院老年口腔科口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川成都610041

龋病发生发展与牙菌斑生物膜微生态平衡密切相关。氧化应激是调控口腔微生物群落组成及结构的重要因素。变异链球菌与龋病的发生发展密切相关,变异链球菌氧化应激耐受能力会影响其在牙菌斑生物膜中的竞争力。变异链球菌氧化应激调控机... 详细信息

龋病发生发展与牙菌斑生物膜微生态平衡密切相关。氧化应激是调控口腔微生物群落组成及结构的重要因素。变异链球菌与龋病的发生发展密切相关,变异链球菌氧化应激耐受能力会影响其在牙菌斑生物膜中的竞争力。变异链球菌氧化应激调控机制包括合成还原酶、通过金属调节蛋白调控铁、锰等金属离子摄入、转录调节因子Spx、从胞外摄取谷胱甘肽及相关的信号传导系统等。目前的研究焦点为变异链球菌如何通过氧化应激反应适应复杂的外环境及对口腔微生态的影响。通过针对关键信号通路设计靶向小分子化合物等途径,抑制变异链球菌氧化应激能力,削弱其毒力,对于口腔微生态调节和龋病防治具有重要意义。

关键词：变异链球菌氧化应激过氧化氢口腔微生态龋病牙菌斑生物膜致龋机制

变异链球菌sepM基因中存在与变链素IV形成相关的突变类型

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南方医科大学学报 2021年第6期41卷 876-882页

作者：刘姗姗刘玉东张容秀路晓淼胡浩胡洁张凯孙钰蚌埠医学院第一附属医院口腔科安徽蚌埠233004 蚌埠医学院组织胚胎学教研室安徽蚌埠233030 蚌埠医学院卫生检验与检疫学教研室安徽蚌埠233030

目的了解sepM基因在变异链球菌临床株中的突变类型及其分布特征;探索sepM基因突变与变异链球菌变链素IV形成能力的关系。方法采用抑菌圈法检测80株变异链球菌临床株的变链素IV形成能力,根据核心基因组多位点序列分型方法构建这80株变异... 详细信息

目的了解sepM基因在变异链球菌临床株中的突变类型及其分布特征;探索sepM基因突变与变异链球菌变链素IV形成能力的关系。方法采用抑菌圈法检测80株变异链球菌临床株的变链素IV形成能力,根据核心基因组多位点序列分型方法构建这80株变异链球菌临床株的最小生成树,根据最大似然法构建这80个样本的进化树。采用GeneMarkS软件预测这些菌株的编码基因,并将预测到的基因与参考基因组UA159的sepM基因序列进行比对,了解sepM基因在变异链球菌临床株中的突变类型及其分布特征。通过分析变链素IV形成组和无变链素IV形成组菌株中差异分布的突变类型及比较突变组和无突变组菌株中抑菌圈的大小,明确与变链素IV形成相关的突变类型。结果 80株变异链球菌临床株中有变链素IV形成(变链素IV形成组)和无变链素IV形成(无变链素IV形成组)的菌株各25和55株。最小生成树结果提示变链素IV形成组菌株之间的等位基因差异少于变链素IV形成组和无变链素形成组组间菌株,并且变链素IV形成组菌株间起源类似。80株变异链球菌临床株中共检测到34个单碱基突变位点,其中有4个碱基突变(C31T、G533A、C756T、C1036T)在组间存在差异(P分别为0.001、变异链球菌临床株sepM基因中存在与变链素IV形成相关的突变类型。

关键词： sepM基因基因突变变链素IV 变异链球菌

变异链球菌hit基因功能及致龋力影响的初步分析

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口腔医学研究 2023年第7期39卷 594-601页

作者：樊紫萱乔里赖扬帆王鹏蒋代仁梁燕叶朝阳罗鹏贵州医科大学公共卫生与健康学院贵州贵阳550025 贵州医科大学附属医院临床医学研究中心贵州贵阳550025 贵州医科大学附属口腔医院牙体牙髓科贵州贵阳550025

目的:初步探讨hit基因对变异链球菌生长和致龋力的影响。方法:通过同源重组构建变异链球菌hit基因缺陷株(Δhit)、hit基因回补株(ΔhitC、ΔhitC-eGFP);观察不同pH下Smu.Δhit、Smu.ΔhitC和ATCC25175模式菌株生长曲线;通过结晶紫染色... 详细信息

目的:初步探讨hit基因对变异链球菌生长和致龋力的影响。方法:通过同源重组构建变异链球菌hit基因缺陷株(Δhit)、hit基因回补株(ΔhitC、ΔhitC-eGFP);观察不同pH下Smu.Δhit、Smu.ΔhitC和ATCC25175模式菌株生长曲线;通过结晶紫染色、蒽酮染色、扫描电镜等实验,比较生长、生物膜形成、粘附、菌体形态差异及耐酸特性;通过人工龋实验,在体外模拟菌株对牙釉产生龋样损坏的差异。结果:成功构建Smu.Δhit、Sum.ΔhitC和Smu.ΔhitC-eGFP菌株;观察发现Smu.Δhit较ATCC25175菌株生长迅速,随着pH值降低,Smu.Δhit生长受到部分抑制,ATCC25175则完全被抑制;Smu.Δhit菌体呈“椭圆球状平铺附着”分散在牙釉面上,胞外生物膜量较少;Smu.Δhit造成的龋样损坏明显强于ATCC25175。结论:hit基因调控变异链球菌生长繁殖,Smu.Δhit缺陷株生长速率显著高于亲本株,更耐受酸性环境,对人牙釉面破坏性更强。

关键词：变异链球菌 ATCC25175 hit基因致龋力 hit-样蛋白

变异链球菌临床菌株分离鉴定及其hit基因致龋性影响的初步研究

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变异链球菌临床菌株分离鉴定及其hit基因致龋性影响的初步研究

作者：王鹏贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:通过从临床患者口腔中直接分离鉴定的变异链球菌株作为亲本实验株,构建hit基因缺陷菌株,以此来研究NCBI所推定hit基因的细菌周期调控功能,并初步探讨hit基因对变异链球菌相关致龋特性包括产酸、耐酸及生物膜形成等的影响。方法:1.... 详细信息

目的:通过从临床患者口腔中直接分离鉴定的变异链球菌株作为亲本实验株,构建hit基因缺陷菌株,以此来研究NCBI所推定hit基因的细菌周期调控功能,并初步探讨hit基因对变异链球菌相关致龋特性包括产酸、耐酸及生物膜形成等的影响。方法:1.在临床上采集患者龈上菌斑,采用MSA(含杆菌肽和1%亚帝酸钾)选择性培养基厌氧培养筛选,通过菌落形态观察、革兰氏染色、细菌生化反应及以分子生物学为基础的变异链球菌hit基因片段PCR扩增测序,对临床分离的变异链球菌进行鉴定,为下一步研究提供实验菌株。2.通过本课题组前期构建的重组质粒p FW5:hit-UP-p FW5-Down,将其线性化处理后转入由感受刺激肽CSP刺激形成的变异链球菌临床分离株感受态后进行同源重组,然后通过1.0 mg/m L高浓度的壮观霉素抗性筛选,并结合PCR产物电泳和Sanger法测序,鉴定筛选变异链球菌临床菌株hit基因缺陷株。3.在p H 7.0±0.3的BHI培养基中,比较变异链球菌临床分离株及其hit基因缺陷株的生长能力,并以课题组前期构建的模式菌株变异链球菌ATCC25175及其hit基因缺陷株作为对照,每组菌株菌液过夜培养,用新鲜BHI培养基(p H7.0±0.3)调至0.5麦氏比浊度(约1.0～2.0 x 10CFU/m L),按1:9(v/v)分别加入至p H 7.0±0.3 BHI培养基中,37℃厌氧培养至少48h,期间每隔1h或2h取出测OD值,根据测出数值绘制生长曲线。4.耐酸试验:以变异链球菌临床分离株hit基因缺陷株为实验组,其亲本临床分离菌株为对照组,两组菌株菌种液过夜培养,用新鲜BHI培养基(p H 7.0±0.3)调至0.5麦氏比浊度,按1:9(v/v)分别加入至p H 4.8 BHI培养基中,37℃厌氧培养至少48h,期间每隔1h或2h取出测OD值,根据测出数值绘制生长曲线。5.产酸试验:两菌株菌液过夜培养,用新鲜BHI培养基(p H 7.0±0.3)调至0.5麦氏比浊度,按1:100(v/v)比例加入到含3%(w/v)蔗糖BHI培养基内,37℃厌氧条件培养,12h和24h后取出离心,测上清液p H值。6.细菌生物膜结晶紫染色定量观察:采用细胞培养96孔板,6行(12孔/行)加入含3%蔗糖BHI液体培养基,按1:9(v/v)比例加入两菌株菌液(用BHI稀释到0.5麦氏浓度),37℃厌氧培养24h后取出,弃菌液,PBS缓冲液漂洗3次,干燥,每孔加入0.1%(w/v)结晶紫溶液100μL,染色20min,吸出染色液,PBS漂洗3次,干燥,每孔加入200μL 95%乙醇溶解结晶颗粒,轻微振荡30min后酶标仪上测OD值。结果:1.随机从MSA板上挑取5个菌斑,经过菌体形态观察、革兰氏染色、细菌生化试验及分子生物学鉴定为变异链球菌,Sanger测序结果为:UA159型变异链球菌株。2.变异链球菌临床分离菌株(UA159)通过转入线性化重组质粒p FW5:hit-UP-p FW5-Down转入进行同源重组,多次1.0 mg/m L高浓度壮观霉素抗性筛选,经hit基因PCR扩增产物电泳和Sanger测序,筛选鉴定出变异链球菌hit基因缺陷株。3.在p H7.0±0.3的BHI培养基中,变异链球菌临床分离株及其hit基因缺陷株在经历近7h迟缓期后几乎同时进入对数期,其亲本菌株约4h后进入稳定期,而hit基因缺陷株持续增长约10h进入稳定期。作为对照的模式菌株ATCC25175迟缓期较长,其hit基因缺陷株则早于亲本菌株进入对数生长期。最后,变异链球菌临床分离株和模式参考菌株ATCC25175两者对应的hit基因缺陷株OD值在20h后逐渐趋于相同。4.在酸性环境p H 4.8的BHI培养基中,变异链球菌临床分离菌hit基因缺陷株仍在约7h迟缓期后进入对数期生长,总体OD值均有所减少,生长速度也受酸性环境影响有所抑制,亲本菌株生长则完全被抑制。5.12h培养后,变异链球菌临床分离株的hit基因缺陷株菌液p H值约为6.30,比临床株较高(p H约4.39,P变异链球菌临床分离株的hit基因缺陷株在24h后形成的生物膜量明显低于临床株(P变异链球菌株。2.临床所分离的变异链球菌可通过基因同源重组方法成功构建hit基因缺陷型菌株。3.hit基因编码的HIT蛋白可抑制细菌快速生长繁殖。4.hit基因缺失后可导致变异链球菌的耐酸性增加,但其糖酵解产酸能力及生物膜形成能力均降低。

关键词：变异链球菌 hit基因同源重组产酸耐酸生物膜

变异链球菌CRISPR-Cas9系统csn2基因突变株的转录组学分析

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四川大学学报（医学版） 2021年第1期52卷 76-81页

作者：何晓雅张安琪龚涛李雨庆口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院成都610041

目的对变异链球菌CRISPR-Cas9系统csn2基因突变株的转录组基因表达差异进行分析。方法培养变异链球菌UA159、csn2基因的缺失菌株Δcsn2及回补菌株。提取总RNA,采用高通量测序技术,进行转录组测序,基于差异表达基因GO和KEGG数据库分析的... 详细信息

目的对变异链球菌CRISPR-Cas9系统csn2基因突变株的转录组基因表达差异进行分析。方法培养变异链球菌UA159、csn2基因的缺失菌株Δcsn2及回补菌株。提取总RNA,采用高通量测序技术,进行转录组测序,基于差异表达基因GO和KEGG数据库分析的基础上,对其参与的生物学过程进行挖掘,采用qRT-PCR的方法验证转录组测序结果。结果转录组结果显示与UA159相比,Δcsn2中基因表达量变化在1倍以上的基因有176个(P<0.05),其中上调表达基因72个,下调表达基因104个,通过GO功能富集分析及KEGG代谢通路富集分析,发现上调和下调的差异表达基因(DEG)均参与的功能为氨基酸转运和代谢。除此之外,上调的DEG参与的生物过程主要与碳水化合物代谢、能量产生和转化、转录等有关;下调的DEG主要与脂质代谢、DNA的复制、重组和修复、信号转导机制、核苷酸转运和代谢等生物过程有关,还有部分DEG的功能尚不清楚。qRT-PCR验证发现,与UA159及Δcsn2/pDL278-csn2菌株相比,与支链氨基酸形成相关的基因leuA、leuC和leuD在Δcsn2中的表达显著下调。结论通过转录组测序和qRT-PCR验证发现Δcsn2中与支链氨基酸合成与细胞膜通透性相关的基因表达量发生了明显变化。

关键词：变异链球菌 CRISPR-Cas csn2 转录组

变异链球菌对人唾液腺细胞系免疫球蛋白受体影响的初步研究

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实用口腔医学杂志 2022年第1期38卷 43-46页

作者：龚吴仪李永明上海牙组织修复与再生工程技术研究中心同济大学口腔医学院同济大学附属口腔医院正畸二科200072

目的:观察变异链球菌(S.mutans)对人唾液腺细胞系(HSG)中多聚免疫球蛋白受体(Pigr)表达的影响。方法:用免疫荧光染色验证细胞系来源与Pigr在HSG中的表达。将对数生长中期的S.mutans水热灭活后与HSG细胞共培养,CCK-8法观察细胞增殖,qPCR... 详细信息

目的:观察变异链球菌(S.mutans)对人唾液腺细胞系(HSG)中多聚免疫球蛋白受体(Pigr)表达的影响。方法:用免疫荧光染色验证细胞系来源与Pigr在HSG中的表达。将对数生长中期的S.mutans水热灭活后与HSG细胞共培养,CCK-8法观察细胞增殖,qPCR与Western blot检测S.mutans对Pigr表达的影响。结果:S.mutans对HSG细胞的增殖无显著影响,但在S.mutans作用下,HSG中Pigr的mRNA及蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。结论:S.mutans可抑制HSG中Pigr的表达。

关键词：变异链球菌免疫球蛋白受体人唾液腺细胞系黏膜免疫

变异链球菌RNC突变株对牙龈卟啉单胞菌黏附能力的影响

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变异链球菌RNC突变株对牙龈卟啉单胞菌黏附能力的影响

作者：赵旻磊锦州医科大学

学位级别：硕士

目的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是慢性牙周炎的主要病原体,龈上菌斑的定植是P.gingivalis造成慢性牙周炎发生和发展的第一步。临床上慢性牙周炎患者常伴有不同程度的龋齿,变异链球菌(Streptococcus mutans,... 详细信息

目的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是慢性牙周炎的主要病原体,龈上菌斑的定植是P.gingivalis造成慢性牙周炎发生和发展的第一步。临床上慢性牙周炎患者常伴有不同程度的龋齿,变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)RNC基因缺失株能够降低龋齿的发生,同时作为口腔早期定植菌可有效降低自身生物膜的形成及抑制生物膜中异种微生物的生存。因此,我们通过构建P.gingivalis菌毛(FimAⅣ)和牙龈素(RgpA)基因缺失株及S.mutans RNC基因缺失株,为探究S.mutans RNC基因缺失株对P.gingivalis生物膜形成能力的影响,揭示RNC基因缺失株抑制P.gingivalis黏附宿主细胞的机制,为RNC基因缺失株用于P.gingivalis相关疾病的预防和治疗应用提供实验依据。方法1.设计扩增FimAⅣ和RgpA基因上下游同源臂,红霉素抗性基因的PCR引物,采用PCR扩增重组DNA片段以电转化的方式对P.gingivalis W83菌株的FimAⅣ与RgpA基因进行全序列敲除。同时,采用q PCR检测野生株,FimAⅣ和RgpA缺失株粘附相关基因表达水平。2.设计扩增RNC基因上下游同源臂,Kana抗性基因的PCR引物,采用PCR扩增重组DNA片段通过自然转化法同时加入S.mutans刺激多肽(CSP)对S.mutans 25172菌株的RNC基因进行敲除。3.S.mutans与P.gingivalis共培养,分析P.gingivalis生物膜形成能力的变化:将不同终浓度的S.mutans(25175野生株和RNC基因突变株)菌体和上清液与终浓度为1x108CFU/m L P.gingivalis(W83野生株,FimAⅣ和RgpA基因突变株)共同厌氧培养72h后,通过结晶紫染色和FITC染色检测P.gingivalis生物膜形成情况。4.S.mutans对P.gingivalis黏附人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)能力的影响:将终浓度为1x108CFU/m L的S.mutans 25175(野生株和RNC基因突变株)菌体和上清与P.gingivalis W83(野生株,FimAⅣ和RgpA基因突变株)共同感染HPDLF细胞1h后,通过q PCR检测P.gingivalis对HPDLF的黏附率。5.S.mutans上清液对P.gingivalis FimAⅣ和RgpA基因m RNA表达水平的影响:将108CFU/m L的S.mutans上清与P.gingivalis W83(野生株,FimAⅣ和RgpA基因突变株)共同感染HPDLF细胞3h后,通过q PCR检测与粘附相关的FimA和RgpA m RNA表达水平。同时,检测蛋白酶R活性情况。结果1.P.gingivalis W83(FimAⅣ和RgpA)和S.mutans 25175(RNC)基因突变株构建成功并得到P.gingivalis W83细菌株最适电转化条件:OD600为0.6,电转化片段1.0μg,电转缓冲液为EP缓冲液,最适电压为2.5kv,最佳转化效率为4.8x104CFU/μg DNA。2.结晶紫染色和FITC染色检测结果显示S.mutans 25175(野生株和RNC基因突变株)均有效降低P.gingivalis W83生物膜的形成(P0.05)4.S.mutans 25175(野生株和RNC基因突变株)上清液降低P.gingivalis的FimAⅣ和RgpA的基因表达水平而提高牙龈素R的活性。结论1.RNC基因突变株相较于S.mutans野生株对P.gingivalis W83生物膜的形成抑制作用更强。2.RNC基因突变株上清液相较于菌体本身能够更有效的降低P.gingivalis W83的菌毛蛋白FimAⅣ和牙龈素RgpA的基因表达水平从而抑制P.gingivalis对HPDLF的黏附能力。3.S.mutans主要作用于P.gingivalis W83的长菌毛(FimAⅣ)从而降低P.gingivalis W83对细胞黏附能力。

关键词：牙龈卟啉单胞菌变异链球菌 HPDLF RNC RgpA FimAⅣ

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变异链球菌低pH感应系统的构建

华西口腔医学杂志 2017年第3期35卷 239-244页

作者：康迪李雨庆周学东口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床研究中心四川大学华西口腔医院成都610041

目的构建变异链球菌低p H感应系统,原位可视地检测其所处环境的p H。方法通过聚合酶链反应(PCR)和基因重组技术,克隆得到唾液链球菌57.I的ureⅠ基因启动子片段(pureⅠ)及绿色荧光蛋白(GFP)的编码基因gfp,经过酶切后将两个基因片段连接融... 详细信息

目的构建变异链球菌低p H感应系统,原位可视地检测其所处环境的p H。方法通过聚合酶链反应(PCR)和基因重组技术,克隆得到唾液链球菌57.I的ureⅠ基因启动子片段(pureⅠ)及绿色荧光蛋白(GFP)的编码基因gfp,经过酶切后将两个基因片段连接融合,然后再经双酶切将融合片段与大肠杆菌-变异链球菌穿梭载体p DL278连接,构建出重组质粒p DL278-pureⅠ-gfp。将重组质粒转化到变异链球菌UA159中,使用荧光显微镜观察其在不同p H条件和不同处理时间的单位面积荧光强度。结果目的基因pureⅠ和gfp扩增片段大小分别为450 bp和717 bp,与预期大小相符。构建的重组质粒p DL278-pureⅠ-gfp测序结果与数据库比对完全一致。重组变异链球菌低p H报告菌株PCR扩增片段与预期结果相符。在一定范围内,变异链球菌低p H感应系统单位面积荧光强度随p H值的降低和处理时间的延长而增强。结论本研究成功构建了变异链球菌低p H感应系统,同时验证了唾液链球菌酸诱导启动子pureⅠ能在变异链球菌中正常发挥功能,为今后研究菌斑生物膜中原位p H的动态变化提供了新方法。

关键词：变异链球菌唾液链球菌绿色荧光蛋白尿素酶启动子