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拟黑多刺蚁mAchR基因发育表达的荧光实时定量RT-PCR检测

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2010年第12期38卷 161-166页

作者：吕淑敏姜鸣卜翠萍奚耕思西北农林科技大学植保资源与病虫害治理教育部重点实验室陕西杨凌712100 陕西师范大学生命科学学院陕西西安710062 中国科学院动物研究所北京100101

【目的】研究毒蕈碱型乙酰胆碱受体(Muscarinic cholinergic receptor,mAchR)在拟黑多刺蚁个体发育中的表达情况,探讨其是否参与拟黑多刺蚁的个体发育行为。【方法】采用SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR方法,检测拟黑多刺蚁卵、幼虫、蛹和成... 详细信息

【目的】研究毒蕈碱型乙酰胆碱受体(Muscarinic cholinergic receptor,mAchR)在拟黑多刺蚁个体发育中的表达情况,探讨其是否参与拟黑多刺蚁的个体发育行为。【方法】采用SYBRGreenⅠ实时定量RT-PCR方法,检测拟黑多刺蚁卵、幼虫、蛹和成虫个体发育阶段mAchR基因mRNA的相对表达量。【结果】mAchR基因在拟黑多刺蚁整个发育过程及各个品级成虫中均有表达。在卵期mAchR mRNA的表达量较幼虫期和蛹期高,而成虫期的表达量最高,可达卵期的3倍以上。3个成虫品级之间,工蚁的表达量最高,雄蚁和雌蚁的表达量在统计学上差异不显著。【结论】mAchR基因参与了拟黑多刺蚁的发育行为,而其主要功能可能是在调节成虫更为复杂的行为中起作用。

关键词：拟黑多刺蚁毒蕈碱型乙酰胆碱受体实时定量RT-PCR 发育表达

鳜碱性肌球蛋白轻链基因cDNA的克隆及其发育表达分析

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水生生物学报 2010年第5期34卷 927-934页

作者：周瑞雪黄斌蒙涛褚武英成嘉赵发兰陈敦学宾石玉张建社长沙大学院生物工程与环境科学系长沙410003 广西师范大学生命科学学院桂林541004 河南信阳师范学院生命科学学院信阳464000

肌球蛋白轻链是构成鱼类肌纤维主要组成部分,在鱼类肌肉生长和收缩过程中具有重要作用。鳜鱼具有生长快、肉质细嫩、味道鲜美、营养成分高等优良的性状。研究通过构建鳜肌肉组织cDNA文库分离到两个碱性肌球蛋白轻链基因,即MLC1和MLC3基... 详细信息

肌球蛋白轻链是构成鱼类肌纤维主要组成部分,在鱼类肌肉生长和收缩过程中具有重要作用。鳜鱼具有生长快、肉质细嫩、味道鲜美、营养成分高等优良的性状。研究通过构建鳜肌肉组织cDNA文库分离到两个碱性肌球蛋白轻链基因,即MLC1和MLC3基因。序列分析显示MLC1和MLC3基因cDNA序列全长分别为1237bp和1070bp,分别编码192和150个氨基酸,除去MLC1N端多出的42个氨基酸残基,MLC1与MLC3氨基酸序列同源性为80.3%。通过PROSITEtools软件预测显示两种轻链都具有两个保守的EF-手相结构,其中第二个EF-hand结构除前三个氨基酸外同源性达100%。鱼类MLC3轻链N端没有高等脊椎动物MLC3特有标志序列。采用实时荧光定量PCR方法对鳜鱼MLC1和MLC3发育性表达分析表明,在原肠期开始有低量表达,与原肠期、尾芽期和肌肉效应期相比,心搏期和仔鱼期MLC1和MLC3表达量显著升高。研究结果首次提供了鳜肌肉组织肌球蛋白主要结构基因的分子生物学信息以及它们在鳜肌肉组织发生和功能的相关性。

关键词：鳜碱性肌球蛋白轻链克隆 cDNA文库发育表达

鳜鱼生肌调节因子MyoD的克隆及其发育表达分析

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湖南师范大学自然科学学报 2013年第4期36卷 63-68页

作者：李玉珑农小献李虹辉王贝贝刘希良褚武英张建社李琦华云南农业大学动物科学学院中国昆明650201 长沙大学生物工程与环境科学系中国长沙410003 广西大学动物科学技术学院中国南宁530004

生肌调节因子是肌肉形成的关键控制因素.通过RT-PCR方法克隆得到鳜鱼主要生肌调节因子MyoD序列.鳜鱼MyoD基因cDNA长度为813 bp,编码270个氨基酸,推导的氨基酸序列含有1个bHLH结构.经与其他动物MyoD氨基酸序列比对发现不同动物MyoD的bHL... 详细信息

生肌调节因子是肌肉形成的关键控制因素.通过RT-PCR方法克隆得到鳜鱼主要生肌调节因子MyoD序列.鳜鱼MyoD基因cDNA长度为813 bp,编码270个氨基酸,推导的氨基酸序列含有1个bHLH结构.经与其他动物MyoD氨基酸序列比对发现不同动物MyoD的bHLH结构域保守性高.通过合成地高辛标记的反义RNA探针对鳜鱼不同发育阶段的胚胎进行整体胚胎原位杂交,结果发现:MyoD最早在肌节早期被检测到信号.伴随着鳜鱼体节从头部往后发育,MyoD也从头部往尾部表达.在体节期,MyoD在中后部表达.尾芽期MyoD的表达量达到最大值.然而,尾芽期过后,头部MyoD的表达量急剧减少,但尾部仍然有强烈的信号.在血流期仍然能在鳜鱼尾部检测到MyoD的微弱信号.到孵出期在鳜鱼鱼眼的后方和胸部腹侧检测到MyoD的强信号,而身体其他地方检测不到信号.仔鱼期没有检测到MyoD表达的信号.

关键词：鳜鱼生肌调节因子 MyoD 整体胚胎原位杂交发育表达

鳜肌球蛋白轻链2基因cDNA的克隆及其发育表达分析

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湖南师范大学自然科学学报 2009年第3期32卷 78-83页

作者：周瑞雪蒙涛褚武英成嘉李志英宾石玉张建社广西师范大学生命科学学院中国桂林541004 长沙学院生物工程与环境科学系中国长沙410003

通过构建肌肉组织cDNA文库分离到鳜肌球蛋白轻链2基因(MLC2),基因登录号为FJ428249.MLC2基因cDNA序列全长1206bp,编码区长度为579bp.MLC2基因开放阅读框编码170个氨基酸,具有EF-手相家族蛋白全部4个EF-手相结构.与已报道的其他动物MLC2... 详细信息

通过构建肌肉组织cDNA文库分离到鳜肌球蛋白轻链2基因(MLC2),基因登录号为FJ428249.MLC2基因cDNA序列全长1206bp,编码区长度为579bp.MLC2基因开放阅读框编码170个氨基酸,具有EF-手相家族蛋白全部4个EF-手相结构.与已报道的其他动物MLC2相比较,所推导氨基酸序列同源性在66.3%～97.6%,其中与Ca2+结合区域非常保守,7种鱼氨基酸序列同源性为100%.采用实时荧光定量PCR方法对鳜MLC2发育表达分析表明,MLC2在原肠期开始有低量表达,与原肠期相比,尾芽期、肌肉效应期和仔鱼阶段MLC2表达量随发育阶段渐进而升高.

关键词：鳜肌球蛋白轻链2 cDNA克隆发育表达

MYOD基因家族在鸭小肠组织发育中的表达研究

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中国家禽 2010年第8期32卷 20-23页

作者：陈禧刘贺贺李亮司建民王继文四川农业大学畜禽品种资源发掘与利用重点实验室四川雅安625014

为研究生肌调节因子MYOD家族对鸭小肠发育的影响,利用QRT-PCR法检测了MYOD家族各成员mRNA在鸭胚第10、14、18、22、27天及出生后1周小肠平滑肌发育过程中的相对表达量。结果表明,4个基因在鸭小肠发育过程中均有表达,且各自的表达量呈现... 详细信息

为研究生肌调节因子MYOD家族对鸭小肠发育的影响,利用QRT-PCR法检测了MYOD家族各成员mRNA在鸭胚第10、14、18、22、27天及出生后1周小肠平滑肌发育过程中的相对表达量。结果表明,4个基因在鸭小肠发育过程中均有表达,且各自的表达量呈现一定的规律性变化。其中MYF5在第10天的表达量最高,之后总体呈下降趋势,到第27天时又达到一个高峰;MYOD1在第10天时表达量最高,之后急剧下降;MYOG的表达量从第10天开始曲折上升,到第22天时达到高峰,之后逐步下降;MYF6在第10天时表达量最高,之后急剧下降。初步推测,MYOD基因家族可能参与了小肠的发育或功能的调控。

关键词： MYOD 平滑肌发育表达 QRT—PCR

豚鼠肺脏上皮细胞形成及Toll样受体（TLR）信号因子的发育表达

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豚鼠肺脏上皮细胞形成及Toll样受体（TLR）信号因子的发育表达

作者：马凌洁宁夏大学

学位级别：硕士

豚鼠是研究人哮喘病、结核病等呼吸道疾病的理想动物模型之一。同时,豚鼠也是研究肺脏的先天免疫机制和呼吸道疾病的致病机理的常用模型。因此,本研究对豚鼠肺脏发育过程中上皮细胞的发育及其Toll样受体(TLRs)信号表达进行了初步的研究... 详细信息

豚鼠是研究人哮喘病、结核病等呼吸道疾病的理想动物模型之一。同时,豚鼠也是研究肺脏的先天免疫机制和呼吸道疾病的致病机理的常用模型。因此,本研究对豚鼠肺脏发育过程中上皮细胞的发育及其Toll样受体(TLRs)信号表达进行了初步的研究。试验中,我们利用组织化学染色(HE)和免疫组织化学(IHC)染色方法对不同发育时期豚鼠呼吸道主要上皮细胞的类型与组成进行了形态学观察,并对TLRs信号分子的发育表达利用定量反转录PCR(qRT-PCR)和免疫印迹(WB)法进行了分析。结果显示,在胚胎(Embryonic)发育到45d和52d时,豚鼠肺脏分别处于假腺期和小管期;在胚胎发育到59d至出生前,肺脏呈现为肺泡增多的囊状期;在出生后7d至成年期(3个月),豚鼠肺脏发育处于肺泡期。IHC结果表明,在胚胎发育的第45d,肺脏存在具有多能性的基底细胞和肺泡Ⅱ型细胞,当胚胎发育到52d时,即肺脏发育的小管期,可以观察到纤毛细胞和Clara细胞。荧光定量PCR分析结果表明,在出生后3个月(成年)、28d、14d、7d利0d,以及胚胎期E45d、E52d和E59d的不同发育阶段,豚鼠肺脏中TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7、 TLR8、TLR9、TLR10、MyD88和TRAF6,这11种TLR相关信号均有表达,但在出生前,各因子的表达量相对高于出生后。其中,在胚胎期E45d、E52d和E59d的豚鼠肺脏组织中,TLR1-10总体的表达水平为显著递增趋势,E52d时,TLR4表达量最高,E45d表达量次之;在E52d和E59d时,TRAF6和MyD88相对表达量最高;而在出生后到成年(3个月)期,各因子的表达量显著降低,且出生后的不同时期,同一因子间的表达差异不显著。同时,利用蛋白免疫印迹Western Blotting技术在蛋白质水平进一步对上述因子的表达进行了验证。上述结果表明,豚鼠肺脏在发育过程中,随着上皮细胞的增殖和分化,肺脏在形态学和功能上趋于成熟。TLRs在出生前的增高现象在分子水平提示豚鼠肺脏出生前的形态功能成熟性,并具备比较完善的免疫反应能力;而出生后这些因子的表达显著降低,将有利于避免机体诱导过度的免疫反应对组织器官造成免疫损伤,并处于随时识别免疫刺激源以激活先天免疫和获得性免疫反应的状态。这些结果都为进一步探讨豚鼠肺脏上皮细胞发育生物学的特征及其先天免疫机制的形成过程等提供了理论依据。

关键词：豚鼠肺脏 TLRs 形态学上皮细胞发育表达先天免疫

文昌鱼AmphiMef2基因的特征及其发育表达

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中国科学（C辑） 2007年第4期37卷 422-426页

作者：张颖王利凤邵明张红卫山东大学生命科学学院发育生物学研究所实验畸形学教育部重点实验室济南250100

肌细胞增强因子2(MEF2)属转录因子MADS家族成员,它能控制脊椎动物肌肉特异基因的表达,但在无脊椎动物中,并非所有的Mef2基因都是肌肉发育所必需的.在青岛文昌鱼(Branchiostomabelcheri)中首次克隆到一个全长的cDNA,定名为AmphiMef2.其... 详细信息

肌细胞增强因子2(MEF2)属转录因子MADS家族成员,它能控制脊椎动物肌肉特异基因的表达,但在无脊椎动物中,并非所有的Mef2基因都是肌肉发育所必需的.在青岛文昌鱼(Branchiostomabelcheri)中首次克隆到一个全长的cDNA,定名为AmphiMef2.其编码的氨基酸序列具有高度保守的MADS和MEF2结构域,与脊椎动物同源蛋白相应区域的氨基酸一致性高达95.3%.原位杂交结果表明,AmphiMef2首先在早神经胚的预定体节中胚层中表达,之后在体节和未分节的预定体节中胚层中表达.36h幼虫期,只在后部体节中检测到它的表达.48h幼虫期,AmphiMef2的表达区域转移到口前窝(一个与脊椎动物腺垂体同源的器官),且持续表达到至少72h幼虫期.实验结果提示,文昌鱼AmphiMef2可能不但参与肌肉发生,而且可能在口前窝的发育或功能发挥中起作用.

关键词： AmphiMef2 文昌鱼(Branchiostoma belcheri) 发育表达肌肉发生口前窝

鳜胃蛋白酶原早期发育表达及两种胃泌素家族基因的克隆与表达

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鳜胃蛋白酶原早期发育表达及两种胃泌素家族基因的克隆与表达

作者：苗伟上海海洋大学

学位级别：硕士

胃蛋白酶原（Pepsinogen, PG）是胃蛋白酶的前体，在胃酸作用下能够激活成为活性形式的胃蛋白酶。本实验室前期获得了鳜(Sinipercachuatsi)三种胃蛋白酶原PG A1、PG A2和PG C cDNA全长序列，为进一步了解鳜胃蛋白酶原早期发育表达特征... 详细信息

胃蛋白酶原（Pepsinogen, PG）是胃蛋白酶的前体，在胃酸作用下能够激活成为活性形式的胃蛋白酶。本实验室前期获得了鳜(Sinipercachuatsi)三种胃蛋白酶原PG A1、PG A2和PG C cDNA全长序列，为进一步了解鳜胃蛋白酶原早期发育表达特征，论文采用荧光定量PCR技术检测了鳜孵化后0-22天（days post hatching, dph）胃蛋白酶原mRNA表达水平变化，结果表明，3种胃蛋白酶原mRNA表达均始于8dph，之后表达量都呈上升趋势，PG A1表达量最高，其次是PG A2，PG C表达量最低。它们的表达各具特点，其中，PG A2在16-22dph表达量比较平稳。三种胃蛋白酶原mRNA的表达时间都早于胃腺的出现时间（13-14dph），推测13dph以前观察到的胃蛋白酶原mRNA表达可能并不是由胃腺表达的，而是由其它组织表达的。胃蛋白酶作为胃蛋白酶原的活性形式，是消化道中的重要消化酶，是胃内酸性消化的执行者，对食物蛋白质的初步消化起重要作用，胃蛋白酶活性的大小反映了胃的消化能力。在鳜早期发育阶段，胃组织尚未分化发育，此时仔鱼消化主要是依靠胞饮作用进行胞内消化，以及碱性消化作用。随着消化系统的发育，出现了胃和胃腺，胃腺分泌胃蛋白酶原，胃蛋白酶原在胃酸作用下形成活性形式的胃蛋白酶，仔鱼消化方式由碱性消化转变为消化道内更有效的酸性消化。本研究检测了鳜孵化后0-22天胃蛋白酶样活性大小变化，结果显示酶样活性呈现较大的波动，在早期（0-8dph）就有检测到较低水平的活性，而此时胃腺尚未出现，胃蛋白酶原基因也未表达，这一时期的胃蛋白酶样活性可能是由母源性的胃蛋白酶或其它天冬氨酸蛋白酶所致。8dph后胃蛋白酶样活性迅速上升，这与胃蛋白酶原mRNA水平的表达特征一致。胃蛋白酶分泌受多种胃肠激素影响，胃泌素（gastrin, GAS）与胆囊收缩素（cholecystokinin, CCK）对胃蛋白酶原分泌都有一定的调控作用，GAS主要刺激胃酸分泌，CCK主要促进胆囊排空及胰液分泌，鱼类中尚缺乏GAS、CCK的功能系统研究。论文采用RACE技术克隆了鳜胃泌素与胆囊收缩素基因cDNA序列，GAS基因cDNA全长581bp，5’非翻译区100bp，3’非翻译区145bp，开放阅读框336bp，编码111个氨基酸;CCK具有2种类型：CCK1与CCK2，CCK1cDNA全长为843bp，5’非翻译区60bp，3’非翻译区369bp，开放阅读框414bp，编码137个氨基酸;CCK2cDNA全长846bp，5’非翻译区112bp，3’非翻译区332bp，开放阅读框403bp，编码134个氨基酸。GAS与CCK成熟肽C末端具有相似的八肽结构（DYQGWVDF/DYLGWMDF），仅在C末端第3位和第6位氨基酸发生替换。荧光定量PCR分析表明，GAS mRNA主要表达于肠和幽门垂，CCK1与CCK2mRNA在脑中表达量最高，在肠和幽门垂也有较高表达，表明GAS与CCK同为消化调控因子，而CCK还是重要神经分泌因子。GAS与CCK mRNA表达贯穿于鳜整个幼体早期发育阶段（孵化后0-22天），前期表达水平较高，后期表达水平较低，并趋于平稳，GAS与CCK mRNA发育表达水平变化可能与这一时期消化道生长发育旺盛有关。

关键词：鳜胃蛋白酶原胃蛋白酶胃泌素胆囊收缩素 cDNA 发育表达组织表达

栉孔扇贝（Chlamys Farreri）两个卵黄蛋白原转录本的发育表达图式

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栉孔扇贝（Chlamys Farreri）两个卵黄蛋白原转录本的发育表达图式

作者：李昀中国海洋大学

学位级别：硕士

卵黄蛋白原（vitellogenin,VTG）是卵黄蛋白（Vn）的前体,能够为发育中的胚胎和幼虫提供营养。对于卵生动物来说,卵黄物质的形成与积累是卵子发生过程中的重要事件。卵黄蛋白是卵黄物质的最主要成分,行使着重要的生物学功能,因此作为卵... 详细信息

卵黄蛋白原（vitellogenin,VTG）是卵黄蛋白（Vn）的前体,能够为发育中的胚胎和幼虫提供营养。对于卵生动物来说,卵黄物质的形成与积累是卵子发生过程中的重要事件。卵黄蛋白是卵黄物质的最主要成分,行使着重要的生物学功能,因此作为卵黄蛋白前体的卵黄蛋白原,具有很高的科研价值。卵黄蛋白原在脊椎动物、昆虫和甲壳动物中已经得到广泛而深入的研究,然而,这些研究仅限于成体特别是性腺发育周期中,对个体发育过程中卵黄蛋白原的特征报道甚少。本研究选取我国重要的水产经济物种——栉孔扇贝（Chlamys farreri）为研究对象,采用cDNA末端快速扩增（rapid-amplification of cDNA ends,RACE）技术获得了栉孔扇贝卵黄蛋白原基因的一个小转录本的cDNA序列（命名为Cf-vtg2）,对其序列特征进行了分析。进一步利用Real-Time PCR和原位杂交技术分析并比较了Cf-vtg2与已获得的栉孔扇贝卵巢Cf-vtg1转录本的个体发育表达图式以及表达差异。另外,利用组织学切片技术对栉孔扇贝的性腺分化进行了观察。本实验克隆得到的Cf-vtg2转录本的cDNA序列长1719 bp,编码564个氨基酸残基。Cf-VTG2与Cf-VTG1的N末端序列几乎完全一致,相似性达99%以上。RT-PCR分析显示,Cf-vtg1 mRNA仅在卵巢中表达,在肝胰腺中表达Cf-vtg2小转录本。Real-Time PCR和原位杂交结果均显示,Cf-vtg （包括Cf-vtg1和Cf-vtg2）在栉孔扇贝的未受精卵、受精卵至D形幼虫中均有表达,说明其母源性的表达特点。其中受精卵时表达量最高,受精之后表达量逐渐下降,至D形幼虫表达量最低,壳顶幼虫未能检测到目的基因的表达。当个体发育至壳高为7 mm的幼贝时,Cf-vtg2首先在肝胰腺中检测出,并且雌雄肝胰腺中的表达量没有显著性差异。原位杂交结果显示Cf-vtg的阳性信号在未受精卵、受精卵至担轮幼虫期呈均匀分布,D形幼虫时信号开始集中于内脏团处,壳顶幼虫时信号消失。在精卵巢分化前后,信号出现在肝胰腺实质细胞中,当个体进入第一次性腺发育周期时,信号则特异性的定位于卵巢的滤泡细胞中。在发育中的精巢中没有检测到目的基因的表达。

关键词：栉孔扇贝卵黄蛋白原发育表达性腺肝胰腺选择性剪接