检索结果-南通市图书馆

作者：刘丰伟福建医科大学

学位级别：硕士

【目的】体外筛选出高亲和力高特异性针对铜绿假单胞菌的适体群;测定适体与铜绿假单胞菌的结合活性,确定其结合率及特异性。【方法】 1.在体外构建两端为固定序列,中间为35个碱基随机区,全长78个碱基的寡核苷酸库,以纯培养的铜绿假单... 详细信息

【目的】体外筛选出高亲和力高特异性针对铜绿假单胞菌的适体群;测定适体与铜绿假单胞菌的结合活性,确定其结合率及特异性。【方法】 1.在体外构建两端为固定序列,中间为35个碱基随机区,全长78个碱基的寡核苷酸库,以纯培养的铜绿假单胞菌为靶标,将二者混合,经过九轮的吸附-漂洗-洗脱-扩增的SELEX过程,筛选针对铜绿假单胞菌高亲和力高特异性的适体,并从第五轮起每隔一轮分别用荧光假单胞、斯氏假单胞和产碱假单胞菌进行反筛,以提高筛选的特异性。每隔一轮利用地高辛-抗地高辛抗体-碱性磷酸酶系统测定ssDNA富集库与铜绿假单胞菌的结合率。 2.将第九轮的筛选产物——寡核苷酸片断进行克隆、测序并用相关软件分析其一级和二级结构。 3.用微量荧光分光光度计检测荧光素标记适体与铜绿假单胞菌的结合率,在5个测序克隆中选出结合率最高的一条适体,分别与铜绿假单胞、门多萨假单胞、斯氏假单胞和产碱假单胞菌做结合反应,以初步检测其特异性。【结果】 1.经过九轮的筛选和扩增,使得针对铜绿假单胞菌的适体逐步得到富集,每轮的ssDNA文库与铜绿假单胞菌的结合率呈上升趋势。将每轮的筛选产物用标有地高辛的引物扩增后,与铜绿假单胞菌进行结合实验,地高辛-抗地高辛抗体-碱性磷酸酶显色系统提示,第九轮筛选获得的富集库与铜绿假单胞菌结合后显色的OD值较第一轮的OD值提高将近3.2倍。 2.在200个克隆子中随机选取27个克隆进行了测序,将测序结果按碱基多少分成A、B两群,A群19条与预期片段大小一致;B群为中间随机区少于35个碱基的片段。将测序适体以计算机软件分析其保守序列及二级结构。二级结构预测以茎-环结构为主,这可能是适体与靶标作用的结构基础。其中适体序列完全相同的共有6条,此序列随机区富含20个G,可能为G四聚体的形成基础。此外,有些序列是单个序列,与任何家族无同源。某些一级结构无同源性的适体克隆二级结构模拟却极为相似,如2-26、2-61、2-119号克隆,2-24、2-46号克隆,2-12、2-135克隆序列等。 3.结合实验显示,2-61号克隆适体与铜绿假单胞菌的结合率最高,为15.3%,2-106号克隆适体与铜绿假单胞菌的结合率最低,为5.6%;2-61号克隆适体与铜绿假单胞、斯氏假单胞菌、产碱假单胞菌和门多萨假单胞,进行结合反应后,测得F值分别为16.6%、3.8%、2.6%和4.5%。【结论】本研究在国内首次利用反向-指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选出针对铜绿假单胞菌的ssDNA适体,并对筛选出的适体进行了结合率及特异性的检测,初步确定了结合率较高特异性较好的适体分子,为荧光基团标记的适体快速鉴定铜绿假单胞菌检测方法的建立奠定了基础。

关键词：铜绿假单胞菌适体 SELEX 反筛荧光基团 dsDNA ssDNA PCR

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鲍曼不动杆菌适配子筛选及初步应用

鲍曼不动杆菌适配子筛选及初步应用

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作者：张亚彬第二军医大学

学位级别：硕士

【目的】用SELEX技术，以鲍曼不动杆菌作为复合靶物质，在体外合成长度为88个nt的随机寡核苷酸文库中，筛选出与鲍曼不动杆菌具有高亲和力高特异性的适配子，再以环氧乙烷丙烯酸珠子作为筛选介质，利用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色... 详细信息

【目的】用SELEX技术，以鲍曼不动杆菌作为复合靶物质，在体外合成长度为88个nt的随机寡核苷酸文库中，筛选出与鲍曼不动杆菌具有高亲和力高特异性的适配子，再以环氧乙烷丙烯酸珠子作为筛选介质，利用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统检测DNA适配子与鲍曼不动杆菌的亲和力，以获得能够结合鲍曼不动杆菌的高亲和力适配子。【方法】 1.在体外构建总长度88nt，中间随机序列为42nt，两端为固定序列的寡核苷酸文，以灭活的鲍曼不动杆菌为靶分子，经过15轮―吸附－漂洗－洗脱－扩增‖的SELEX筛选，筛选出针对鲍曼不动杆菌高亲和力高特异性的适配子，用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统利进行ssDNA富集库与鲍曼不动杆菌的结合力测定。 2.在第12轮、第13轮，第14轮和第15轮分别同时进行ssDNA文库与洛菲不动杆菌和溶血不动杆菌进行反筛，运用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统来比较经过反筛和未经过反筛获得的ssDNA富集库与鲍曼不动杆菌的结合力。 3.将第9轮和第12轮、第15轮筛选得到的产物进行扩增、纯化， TA克隆、测序后并用相关软件分析其一级机构与二级结构。筛选得到的产物经扩增后在聚丙烯酞胺凝胶电泳图中显示，伴随着筛选轮数的递增，PCR扩增电泳条带逐渐单一纯化。 4.利用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统进行鲍曼不动杆菌与适配子的结合力测定，选出OD值较高的3个适配子，测定其亲和力;对亲和力最高的克隆适配子，做进一步的特异性与灵敏度分析。我们还运用DFA（dot filtration assay，DFA）对B20适配子与同菌属其他不动杆菌进行反筛选做特异性检测。【结果】 1.随着筛选轮数的增加，鲍曼不动杆菌与ssDNA富集库结合的OD值不断的增加， 2.在第12轮反筛选得到的富集库与鲍曼不动杆菌结合后显色的OD值（0.469）是第一轮OD值（0.023）的20.39倍。从13轮、14轮、15轮的OD值可以看出，当ssDNA富集库与鲍曼不动杆菌的结合位点逐渐趋于饱和后，吸附到鲍曼不动杆菌上的ssDNA就不再增加。 2.在第11轮筛选时，出现了O.D值降低，这可能是由于筛选压(选择/进化压)的影响，从而使我们所期望得到的寡核昔酸片段出现非特异性的增强。 3.比较经过反筛与未经过未反筛的ssDNA富集库与鲍曼不动杆菌结合的OD值，发现有明显的差异，最低的第15轮的反筛和未反筛的OD比值为1.7倍，到最高的第12轮比值的40倍。 4.克隆测序结果表明，第9轮、第12轮和第15轮未反筛的序列均未出现富集，而对第15轮反筛的克隆子进行测序，则发现在23个预期的随机序列中，有3条序列富集,相似度极高(B20、B35和B44)，同源性分析高达92%。我们利用DNASTAR软件对序列的一级结构同源性做比较，可将分成9个家族(Family)，再利用DNASISV2.5软件分别进行计算。其中有个别序列与任何一个家族均无关系。 5.克隆适配子B20、B35和B44与鲍曼不动杆菌结合的OD值明显增高;进行亲和力测定，可知：B20的Kd为17.89nM，B35为86.83nM，B44为103.99nM;通过适配子B20灵敏度的结合测定，可知细菌数最低可至2.5×106。【结论】本研究运用SELEX技术，并利用该菌属其他不动杆菌进行反筛，经15轮筛选，得到针对鲍曼不动杆菌的ssDNA适配子，通过运用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统和DFA技术对已筛选得到的适配子进行特异性、灵敏度和亲和力的分析，已成功筛选到亲和力高、特异性强的鲍曼不动杆菌适配子。

关键词： SELEX(指数富集配基的系统进化技术) 鲍曼不动杆菌适配子反筛生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统斑点渗滤法

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任意大于25的偶数的一个性质

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洛阳大学学报 2002年第2期17卷 24-25,28页

作者：符文通马国祥新疆阿克苏农业专科学校新疆阿克苏843000 洛阳铁路四中河南洛阳471002

证明了每个大于 2 5的偶数都能表示成两个素数的和 ,并且表示的方法种数为 :Dp(N)≥ 2k-3 .

关键词： 25 偶数正筛反筛复筛超复筛素数和表示法表示种数

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