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胃肠病学和肝病学杂志 2004年第1期13卷 17-19页

作者：王建军成军刘妍张黎颖郭江纪冬杨倩党晓燕王春花徐志强解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心

目的　应用抑制性消减杂交 (SSH )技术及生物信息学技术 (bioinformatics)筛选并克隆乙型肝炎病毒 (HBV)e抗原(HBeAg)反式激活新型靶基因。方法　以HBeAg表达质粒pcDNA3 .1(-) HBeAg转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为平行对照 ,提... 详细信息

目的　应用抑制性消减杂交 (SSH )技术及生物信息学技术 (bioinformatics)筛选并克隆乙型肝炎病毒 (HBV)e抗原(HBeAg)反式激活新型靶基因。方法　以HBeAg表达质粒pcDNA3 .1(-) HBeAg转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交 (SSH)分析。对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性 ,利刚表达序列标签 (EST)序列的搜索和比对 ,进行电子拼接 ,根据基因起始密码子的KozaK规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,命名为HBeAgTP ,在GenBank中注册 ,注册号为AY42 3 62 4。结果　HBeAgTP基因的编码序列全长为 3 2 4个核苷酸 (nt) ,编码产物由 10 7个氨基酸残基 (aa)组成。结论　HBeAg反式激活新型靶基因HBeAgTP的筛选与克隆。

关键词：乙型肝炎病毒 E抗原反式激活靶基因克隆逆转录多聚酶链反应基因转染

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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究

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肝脏 2005年第1期10卷 24-26页

作者：刘妍成军王建军白桂芹王志凌郭风劲纪冬崔玉芳北京解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心全军病毒性肝炎防治研究重点实验室

目的　应用抑制性消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库 ,克隆HCVNS4B蛋白反式激活相关基因。方法　以HCVNS4B表达质粒pcDNA3 .1( ) NS4B... 详细信息

目的　应用抑制性消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库 ,克隆HCVNS4B蛋白反式激活相关基因。方法　以HCVNS4B表达质粒pcDNA3 .1( ) NS4B转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1( )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,进行抑制性消减杂交分析。将富集的二次PCR产物与T A载体连接 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑取克隆聚合酶链反应 (PCR)扩增后进行测序及同源性分析。结果　文库扩增后得到 3 3个阳性克隆 ,经菌落PCR分析显示其中 2 8个克隆含有大小不等的 2 0 0～ 10 0 0bp插入片段。测序及同源性分析显示 ,12种已知基因编码蛋白 ,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS4B反式激活靶基因。结论　成功构建了HCVNS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,为进一步阐明HCVNS4B反式调节的靶基因在肝炎。

关键词： NS4B 非结构蛋白反式激活基因克隆化研究丙型肝炎病毒(HCV) 聚合酶链反应(PCR) cDNA消减文库抑制性消减杂交分析反式激活相关基因 HepG2细胞反式激活靶基因分子生物学机制同源性分析基因编码蛋白蛋白编码基因

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应用抑制性消减杂交技术筛选NS5ATP5的上调基因

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胃肠病学和肝病学杂志 2004年第1期13卷 35-38页

作者：党晓燕张健成军邓红王建军王春花纪冬解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心北京100039

目的　通过抑制性消减杂交 (SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)NS5A反式激活蛋白 5 (NS5ATP5 )的反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库 ,筛选HCVNS5ATP5蛋白反式激活靶基因。方法　以HCVNS5ATP5表达质粒pcDNA3 .1(-) NS5ATP5转染HepG... 详细信息

目的　通过抑制性消减杂交 (SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)NS5A反式激活蛋白 5 (NS5ATP5 )的反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库 ,筛选HCVNS5ATP5蛋白反式激活靶基因。方法　以HCVNS5ATP5表达质粒pcDNA3 .1(-) NS5ATP5转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,从中提取mRNA并合成cDNA ,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果　成功构建人HCVNS5ATP5蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 91个白色克隆 ,进行菌落PCR分析 ,其中 86个均得到 10 0～ 10 0 0bp插入片段。挑取 3 2个插入片段测序分析。其中包括结缔组织生长因子、纤维连接蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白l等重要的基因。

关键词：抑制性消减杂交技术 NS5ATP5 丙型肝炎病毒 cDNA消减文库反式激活靶基因

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