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绵羊肺炎支原体荚膜多糖的提取纯化及反应原性分析

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中国兽医科学 2024年第1期54卷 41-47页

作者：田彤彤葛家振李倩倩高鹏程吴晓妮宋国栋刘一健郑福英储岳峰新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046 西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州730030

本研究旨在提取绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)GH3-3的荚膜多糖,并验证其反应原性。用无水乙醇沉淀得到粗荚膜多糖,再通过苯酚抽提、酶处理去除核酸和蛋白质,进而纯化得到荚膜多糖,利用免疫荧光试验证明该荚膜多糖的反应... 详细信息

本研究旨在提取绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)GH3-3的荚膜多糖,并验证其反应原性。用无水乙醇沉淀得到粗荚膜多糖,再通过苯酚抽提、酶处理去除核酸和蛋白质,进而纯化得到荚膜多糖,利用免疫荧光试验证明该荚膜多糖的反应原性,利用刚果红试验检测其是否具有三螺旋结构。从1 L培养基上清中初步提取得到Mo GH3-3粗荚膜多糖12.24 mg,经过纯化得到9.8 mg的精制荚膜多糖,其纯化得率约为80%。免疫荧光试验结果表明Mo GH3-3荚膜多糖具有良好的反应原性,刚果红试验首次证明绵羊肺炎支原体荚膜多糖具有三螺旋结构。经过乙醇沉淀、苯酚抽提、酶处理、超滤浓缩后,得到高纯度的Mo GH3-3荚膜多糖。该提取纯化方法简便、成本低,便于生产实践中应用。荚膜多糖具有反应原性和三螺旋结构,证明其生物活性良好,为相关诊断试剂、疫苗、佐剂等的研发提供了可参考的多糖制备方法。

关键词：绵羊肺炎支原体荚膜多糖三螺旋结构反应原性

马驽巴贝虫metacaspase基因的克隆、表达、反应原性鉴定和生物信息分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年

作者：任冀超甘露郑会珍冯秀娟崔泽云李佳欣金依璇张伟郭庆勇巴音查汗·盖力克李永畅新疆农业大学动物医学学院新疆农业大学动物医学学院

目的克隆、表达马驽巴贝虫精氨酸/赖氨酸特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（BcMC），鉴定其反应原性并分析其生物学信息。方法根据马驽巴贝虫部分基因序列设计并合成Bcmc基因序列扩增引物，采用PCR扩增Bcmc基因，将扩增出的基因片段克隆... 详细信息

目的克隆、表达马驽巴贝虫精氨酸/赖氨酸特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（BcMC），鉴定其反应原性并分析其生物学信息。方法根据马驽巴贝虫部分基因序列设计并合成Bcmc基因序列扩增引物，采用PCR扩增Bcmc基因，将扩增出的基因片段克隆至原核表达载体pET-28a，提取质粒进行双酶切、PCR和测序鉴定，将重组质粒转入感受态细胞E. coli BL21 (DE3)，经0.8 mmol/L IPTG诱导表达后，采用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的表达情况。用His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白后，以马驽巴贝虫感染阳性血清为一抗，Western blotting分析重组蛋白的反应原性。采用ProtParam等生物信息学在线软件预测Bcmc基因的理化性质、磷酸化位点、亚细胞定位、抗原表位、二级和三级结构、蛋白互作网络，对比BcMC与疟原属MC-1 (PsMC-1)和泰式锥虫MC (TtMC)的三级结构。Bcmc序列在NCBI上进行BLAST比对，使用Mega 7.0软件，采用邻接法（neighbor-joining,NJ）构建基于mc基因序列的系统进化树。结果 Bcmc基因PCR扩增产物大小约为996 bp，与预期片段一致。重组质粒pET28a-Bcmc经双酶切、PCR和测序鉴定表明插入的目的基因正确。SDS-PAGE结果显示，重组蛋白以包涵体的形式表达，相对分子质量（Mr）约为36 000。Western blotting结果表明，纯化后的BcMC可与马驽巴贝虫感染阳性血清发生特异性反应。生物信息学分析结果显示，BcMC的Mr为36956.72；具有25个磷酸化点位；亚细胞定位预测位于线粒体的比例为10%;B细胞抗原表位分析发现该蛋白含有12个潜在抗原表位；BcMC蛋白的二级结构中，无规则卷曲占50.30%、α-螺旋占23.19%;BcMC的三级结构与PsMC-1和TtMC相似；蛋白互作网络预测结果显示，与BcMC相互作用的蛋白及BcMC参与的生物过程均与细胞凋亡有关。BLAST比对结果和系统进化树分析结果显示，Bcmc与马泰勒虫（CP099439）、马泰勒虫WA株（XM＿004830992）的mc基因序列一致性均为99.90%，进化树上聚为一支，亲源关系较近。结论 BcMC原核表达蛋白具有良好的反应原性，生物信息学分析表明BcMC参与马驽巴贝虫凋亡的生物过程。

关键词：驽巴贝虫精氨酸/赖氨酸特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶马反应原性生物信息分析

滑液支原体烯醇化酶在感染宿主中的反应原性和细胞黏附性

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中国兽医学报 2024年第1期44卷 88-96页

作者：徐彬孙玉王树于岩飞王晓丽马孙婷孙华伟张敬峰刘传敏吕立新冯志新熊祺琰邵国青张小飞欧阳伟江苏省农业科学院兽医研究所国家兽用生物制品工程技术研究中心/农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室/江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地江苏南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏泰州225300 江苏大学生命科学学院江苏镇江212013 江苏大学医学院江苏镇江212013 南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏大学食品与生物工程学院江苏镇江212013

滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是一种重要的禽病病原,严重危害我国养禽业。本研究旨在分析MS烯醇化酶(enolase,Eno)参与病原致病和诱导感染宿主免疫相关的功能。对MS的Eno蛋白进行种内和种间同源性和进化树分析,并预测Eno的蛋白... 详细信息

滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是一种重要的禽病病原,严重危害我国养禽业。本研究旨在分析MS烯醇化酶(enolase,Eno)参与病原致病和诱导感染宿主免疫相关的功能。对MS的Eno蛋白进行种内和种间同源性和进化树分析,并预测Eno的蛋白结合位点和B细胞表位。MS Eno在不同MS菌株间同源性较高,且有别于其他物种。B细胞表位广泛分布在Eno蛋白的各个部分,且大都与预测的蛋白结合位点有重合。进行Eno原核表达和纯化,制备兔抗Eno多克隆抗血清。利用Western blot分析Eno在MS感染鸡或灭活苗免疫鸡中的反应原性。结果显示,MS Eno与兔抗Eno多克隆抗血清、兔抗MS多克隆抗血清、灭活疫苗(HN01株或YBF-MS1株)高免鸡血清、HN01强毒攻毒后阳性鸡血清、3个不同地方来源的临床阳性鸡血清均能发生反应,说明其在疫苗免疫和病原感染鸡中均表现有反应原性。利用菌落印迹和双荧光检测分析并证实Eno为外膜蛋白。利用间接免疫荧光和ELISA板结合试验分析Eno对鸡滑膜鞘细胞(synovial sheath cells,SSCs)是否具有黏附素作用。试验证实Eno对SSCs具有黏附作用,且此黏附作用具有Eno浓度依赖性。以上证明MS Eno在病原感染和灭活苗免疫鸡中具有反应原性,并作为外膜锚定的细胞黏附素参与对关键宿主细胞SSCs的黏附,为后续深入研究Eno的致病和免疫相关功能提供了重要参考。

关键词：滑液支原体烯醇化酶反应原性细胞黏附

流产布鲁菌免疫原性蛋白SSB的鉴定及其反应原性分析

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中国动物传染病学报 2022年第3期30卷 79-87页

作者：宋美莹田明星连拯民尹伊李子晨胡海管祥丁铲蔡玉梅于圣青山东农业大学动物科技学院泰安271018 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

本研究通过免疫印迹试验分析流产布鲁菌感染小鼠不同阶段的血清中以及临床牛羊布病阳性血清中抗体生成规律和特点,确定布鲁菌主要免疫原性蛋白的相对区域。结果显示:布鲁菌感染小鼠2周后抗体逐渐产生,在6~8周达到顶峰,之后维持稳定状态... 详细信息

本研究通过免疫印迹试验分析流产布鲁菌感染小鼠不同阶段的血清中以及临床牛羊布病阳性血清中抗体生成规律和特点,确定布鲁菌主要免疫原性蛋白的相对区域。结果显示:布鲁菌感染小鼠2周后抗体逐渐产生,在6~8周达到顶峰,之后维持稳定状态;结合临床牛羊血清分析发现布鲁菌免疫原性蛋白主要集中在相对分子量40~70 kDa和7~20 kDa的两个区域;通过SDS-PAGE分离布鲁菌总蛋白,对照免疫印迹试验结果,切取免疫原性蛋白条带进行质谱分析,共鉴定到10个布鲁菌免疫原性蛋白;在大肠杆菌中成功表达和纯化了免疫原性蛋白SSB;免疫印迹试验显示,纯化的SSB蛋白可与临床牛布病阳性血清产生较好的反应,但检测阳性样本时也会产生阴性反应,检测效率与虎红平板凝集试验相比略差,在检测阳性样本时,与虎红平板凝集试验的符合率约为82%。该研究为布病诊断试剂研发奠定基础。

关键词：流产布鲁菌免疫原性蛋白 SSB蛋白反应原性

鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达与反应原性分析

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黑龙江畜牧兽医 2022年第23期 67-71页

作者：曲哲会张喜文齐志颖李卓燕李盼盼吕硕硕张雯赵聘焦凤超赵云焕黄立王丹娜信阳农林学院动物科技学院河南信阳464000 河南省水禽资源开发利用与疫病防控工程技术研究中心河南信阳464000 信阳市畜禽养殖与环境控制重点实验室河南信阳464100 兆丰华生物科技(南京)有限公司北京生物医药科技中心北京102600

为了利用原核表达系统表达鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus, DTMUV)E蛋白,试验利用RT-PCR方法扩增DTMUV E基因,经核苷酸序列测定后,与pET-30a(+)载体连接,然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建重组表达载体pET-DTMUV-E,再转化至... 详细信息

为了利用原核表达系统表达鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus, DTMUV)E蛋白,试验利用RT-PCR方法扩增DTMUV E基因,经核苷酸序列测定后,与pET-30a(+)载体连接,然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建重组表达载体pET-DTMUV-E,再转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达DTMUV E蛋白,通过SDS-PAGE分析表达产物,Western-blot方法鉴定反应原性,分别从诱导时间和IPTG浓度方面对表达条件进行优化,并进行表达产物的可溶性分析。结果表明:克隆得到大小约为1 503 bp的DTMUV E基因,并成功与pET-30a(+)载体连接,获得分子质量约65 ku的融合蛋白,可以与兔抗6×His多克隆抗体和鸡抗DTMUV多克隆抗体发生特异性免疫反应,终浓度为4 mmol/L的IPTG诱导4 h为最佳表达条件,重组蛋白DTMUV E主要以包涵体形式表达。说明利用原核表达系统表达的以包涵体形式存在的DTMUV E蛋白,具有较好的反应原性。

关键词：鸭坦布苏病毒 E蛋白原核表达系统反应原性可溶性分析

鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ-Ⅱ与Ⅲ的反应原性和免疫原性比较

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黑龙江畜牧兽医 2023年第20期 89-95,100页

作者：曲哲会鲁绍芳郭晓秋陈敏焦凤超王梦瑶魏星马君钊张茹黄立张喜文信阳农林学院动物科技学院河南信阳464000 河南省水禽资源开发利用与疫病防控工程技术研究中心河南信阳464000 信阳市畜禽重大疫病防控综合技术研究重点实验室河南信阳464000

为了比较鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)E蛋白结构域Ⅰ-Ⅱ(EDⅠ-Ⅱ)与结构域Ⅲ(EDⅢ)的反应原性和免疫原性,试验将重组质粒pET-EDⅠ-Ⅱ[EDⅠ-Ⅱ基因插入表达载体pET-30a(+)构建的重组质粒]和pET-EDⅢ[EDⅢ基因插入表达载体pET-... 详细信息

为了比较鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)E蛋白结构域Ⅰ-Ⅱ(EDⅠ-Ⅱ)与结构域Ⅲ(EDⅢ)的反应原性和免疫原性,试验将重组质粒pET-EDⅠ-Ⅱ[EDⅠ-Ⅱ基因插入表达载体pET-30a(+)构建的重组质粒]和pET-EDⅢ[EDⅢ基因插入表达载体pET-30a(+)构建的重组质粒]分别转化至大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,采用亲和层析法纯化重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ,通过Dot-blot试验和间接ELISA试验比较二者的反应原性;将重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ免疫小鼠,通过测定免疫小鼠血清中特异性抗体、病毒中和(VN)抗体和细胞因子(IL-6、IFN-γ)水平比较两者的免疫原性;将DTMUV分离株感染重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ免疫小鼠,采用实时荧光定量PCR方法检测小鼠肺脏、肝脏和脑组织中DTMUV RNA相对表达水平,比较重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ对免疫小鼠的保护力。结果表明:含重组质粒pET-EDⅠ-Ⅱ和pET-EDⅢ诱导4 h的菌体蛋白经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定分别在分子量约33 ku和17 ku位置出现明显条带,可与鸡抗DTMUV多克隆抗体发生特异性免疫反应;经Dot-blot试验和间接ELISA试验分析发现,重组蛋白EDⅠ-Ⅱ比重组蛋白EDⅢ具有更好的反应原性;重组蛋白EDⅠ-Ⅱ免疫小鼠后第42天血清中特异性抗体水平、IFN-γ和IL-6水平均极显著高于重组蛋白EDⅢ(P<0.01或P<0.001),但VN抗体水平极显著低于重组蛋白EDⅢ(P<0.01);免疫小鼠感染DTMUV后,重组蛋白EDⅢ免疫小鼠肺脏、肝脏和脑组织中DTMUV mRNA相对表达水平均显著或极显著低于重组蛋白EDⅠ-Ⅱ免疫小鼠(P<0.05或P<0.01),即EDⅢ蛋白诱导小鼠产生的免疫应答较EDⅠ-Ⅱ蛋白对于抑制DTMUV复制的效果更好。说明EDⅠ-Ⅱ蛋白更适合作为以E蛋白及相关特异性抗体为基础的免疫学检测方法研究的目标蛋白,而EDⅢ蛋白更适合作为DTMUV新型疫苗研究的目标蛋白。

关键词：鸭坦布苏病毒 E蛋白结构域反应原性免疫原性

非洲猪瘟病毒多种靶向蛋白的原核表达、反应原性分析及ELISA方法的初步建立

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非洲猪瘟病毒多种靶向蛋白的原核表达、反应原性分析及ELISA方法...

作者：鲍丽茹内蒙古农业大学

学位级别：硕士

非洲猪瘟(ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染猪科动物而患发的一种急性、烈性、高度传染性动物疫病。自1909年在非洲发现首个病例,之后疫情便在欧美洲等数十个国家广泛流行,随后又蔓延至俄罗斯等国,2018年8月,在我国辽宁省沈阳市发现... 详细信息

非洲猪瘟(ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染猪科动物而患发的一种急性、烈性、高度传染性动物疫病。自1909年在非洲发现首个病例,之后疫情便在欧美洲等数十个国家广泛流行,随后又蔓延至俄罗斯等国,2018年8月,在我国辽宁省沈阳市发现首例非洲猪瘟病例,此后疫情便在全国蔓延,给我国养殖产业带来巨大经济损失。本试验把已经发表了的非洲猪瘟病毒基因核酸序列作为基础,用引物进行PCR扩增,将得到的4个目标基因片段克隆到p ClodⅠ原核表达载体中,得到4个重组质粒:K145R、A240L、CP204L、K205R。将4个酶切鉴定正确的重组质粒以及由实验室保存的已鉴定正确的20个阳性重组质粒转化到宿主菌E.coli BL21(DE3)中,15℃诱导24个小时后,通过SDS-PAGE蛋白电泳分析靶蛋白的表达情况。所有的重组蛋白都以可溶性表达和包涵体表达两种形式进行表达,可溶性蛋白取超声裂解后的上清液,过滤除菌后,使用纯化试剂盒进行纯化,而包涵体蛋白的沉淀选用含6 m M尿素或8m M盐酸胍的变性剂溶解,再取高速离心后收集的上清液和沉淀,进行SDS-PAGE蛋白电泳分析验证。试验结果发现各重组蛋白在上清的实际大小与理论值相符,大小均约在10～70 kd之间。经资料查询,这些蛋白包括ASFV结构性蛋白、病毒复制相关的酶、免疫与炎症相关的蛋白、病毒复制和病毒粒子成熟有关的蛋白,以及目前尚未了解其功能的部分蛋白,选取这些已表达的24个ASFV重组蛋白与免疫攻毒后不同时期的猪阳性血清进行反应,通过Western blotting分析鉴定这些蛋白在宿主感染ASFV后在体内产生抗体的早晚和强度,结果表明24个重组蛋白均显示出良好的反应原性。选择其中已纯化的重组蛋白K205R作为包被的抗原,以免疫猪攻毒后的阳性血清作为第一抗体,用辣根过氧化酶标记的兔抗猪抗体作为第二抗体,初步建立一种用于ASFV抗体检测的间接ELISA方法。与商用试剂盒对比,阳性符合率为96.6%。本试验将为我国非洲猪瘟监测、疫情预防和控制以及净化提供技术支持。

关键词：非洲猪瘟病毒原核表达反应原性 ELISA方法建立

细粒棘球绦虫膜联蛋白B5、B15和B25的原核表达和分泌特性分析

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畜牧兽医学报 2024年第6期55卷 2607-2618页

作者：陈延鑫华瑞其邵国庆朱小伟侯巍李盛琼阳爱国杨光友四川农业大学动物医学院成都611130 四川省动物疫病预防控制中心成都610000

旨在探讨细粒棘球绦虫膜联蛋白B5、B15和B25的反应原性及其在中间宿主组织中的分泌特性,为进一步研究细粒棘球绦虫膜联蛋白与中间宿主的相互作用奠定基础。作者提取细粒棘球蚴原头蚴的总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增获得EgAN... 详细信息

旨在探讨细粒棘球绦虫膜联蛋白B5、B15和B25的反应原性及其在中间宿主组织中的分泌特性,为进一步研究细粒棘球绦虫膜联蛋白与中间宿主的相互作用奠定基础。作者提取细粒棘球蚴原头蚴的总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增获得EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25基因全长编码序列,使用同源重组法构建pET32a-EgANXB5、pET32a-EgANXB15和pET32a-EgANXB25质粒并进行重组蛋白的原核表达,应用蛋白免疫印迹对上述重组蛋白进行鉴定,并采用免疫荧光染色试验分析EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25在中间宿主组织中的分泌特性。结果显示:本研究成功克隆并表达出重组EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25,并更正了EgANXB25的CDS序列(GenBank:OR245515.1)。蛋白免疫印迹结果显示,这3种蛋白均能够被感染细粒棘球绦虫的犬阳性血清和感染细粒棘球蚴的小鼠阳性血清所识别。同时,免疫荧光染色结果显示,在细粒棘球蚴包囊附近的肝实质组织中可以检测到EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25的阳性信号。EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25具有良好的反应原性,同时它们具有分泌进入包囊周围肝实质组织中的潜能,可能进一步参与细粒棘球蚴与宿主的相互作用。

关键词：细粒棘球绦虫膜联蛋白原核表达反应原性分泌特性

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毒害艾美耳球虫谷胱甘肽过氧化物酶EnGPX的原核表达与分析

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畜牧兽医学报 2024年第2期55卷 846-853页

作者：彭月梅叶状汪飞燕王礼跃冯永翠王乐乐候照峰许金俊陶建平刘丹丹扬州大学兽医学院扬州225009 扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

旨在研究毒害艾美耳球虫谷胱甘肽过氧化物酶EnGPX的反应原性及其在虫体内的亚细胞定位。提取毒害艾美耳球虫(扬州株)配子体总RNA,RT-PCR扩增En GPX的ORF编码序列,构建原核表达质粒pET-28a(+)-En GPX,转化至BL21(DE3)进行体外诱导表达,... 详细信息

旨在研究毒害艾美耳球虫谷胱甘肽过氧化物酶EnGPX的反应原性及其在虫体内的亚细胞定位。提取毒害艾美耳球虫(扬州株)配子体总RNA,RT-PCR扩增En GPX的ORF编码序列,构建原核表达质粒pET-28a(+)-En GPX,转化至BL21(DE3)进行体外诱导表达,同时制备鼠抗rEnGPX多克隆抗体,对重组蛋白进行Western blot反应原性分析和激光共聚焦免疫荧光定位分析。结果表明,En GPX ORF序列全长753 bp,编码250个氨基酸,体外重组表达蛋白大小约30 ku,主要以包涵体形式存在。该重组蛋白能被6×HIS标签单克隆抗体,鼠抗rEnGPX多克隆抗体,毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫病鸡康复血清所识别,表明其具有较好的反应原性和交叉反应原性。在天然配子体蛋白中检测出EnGPX,其编码蛋白主要分布于配子体内的Ⅱ型成壁体(WFBII)及卵囊壁上。本研究成功克隆表达了毒害艾美耳球虫谷胱甘肽过氧化物酶EnGPX,验证其具有良好的反应原性,并定位于配子体及卵囊壁上。以期为研究En GPX参与卵囊壁形成的分子机制提供新的线索,也为研制新型球虫亚单位疫苗提供新的靶标。

关键词：毒害艾美耳球虫 EnGPX 克隆表达反应原性免疫荧光定位